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本文作者：蘭海云 汪愛勤 尹文 單位：第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 第四軍醫(yī)大學(xué)中心實驗室

在體成像技術(shù)的發(fā)展及成像策略的不斷提高，能夠在活的生物體內(nèi)揭示細(xì)胞和分子水平的諸多細(xì)微變化，有助于在生物整體、真實的體內(nèi)環(huán)境中高時間分辨率地研究生命過程。針對某一生物過程的帶有光學(xué)標(biāo)記的報告基因已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)的研究，近年來正被更多地用于在活的動物模型中探究人體內(nèi)生理機能和疾病的生物學(xué)過程。利用熒光蛋白、螢光素酶基因等生物材料標(biāo)記細(xì)胞、病原體和基因，早已被證實是一種在體內(nèi)設(shè)置“檢測器”、體外直觀檢測的非常可行的策略[1]。

1在體生物發(fā)光成像技術(shù)的原理

通過生物技術(shù)將構(gòu)建的以螢光素酶基因作為標(biāo)記基因的載體（重組原核表達(dá)質(zhì)粒、重組真核表達(dá)質(zhì)粒或重組病毒），經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染并篩選得到重組病原菌、細(xì)胞（如免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等）或重組病毒（如腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等）用于轉(zhuǎn)入小動物；或是將含螢光素酶及調(diào)控序列的載體線性化后經(jīng)顯微注射等技術(shù)穩(wěn)定整合于小動物基因組制備轉(zhuǎn)基因動物[2－4]。標(biāo)記基因的表達(dá)可通過多種調(diào)控元件進(jìn)行調(diào)控，如靶基因的啟動子和增強子等；標(biāo)記的方法因研究領(lǐng)域、研究目的和實驗策略的不同而各異[4]，但最終都是在體內(nèi)組織如血液、肝臟、腦、脾、腎等靶部位因特定生物過程的發(fā)生而伴隨產(chǎn)生有酶活性的螢光素酶。在注入底物即螢光素的條件下，螢光素酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生特定波長的光信號，通過成像系統(tǒng)可以直觀檢測到光信號的產(chǎn)生及變化，實時反映體內(nèi)發(fā)生的生物過程，如基因的調(diào)控表達(dá)、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)之間的相互作用、細(xì)胞增殖與分化等。因此，在體生物發(fā)光成像技術(shù)可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)與免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域[5－8]。

2在體生物發(fā)光成像技術(shù)的應(yīng)用

2．1標(biāo)記于腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等，轉(zhuǎn)入體內(nèi)后進(jìn)行成像

螢光素酶基因作為一種報告基因，最初應(yīng)用于體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)研究。在體生物發(fā)光成像技術(shù)的發(fā)展，使其能夠應(yīng)用于在體組織細(xì)胞的表達(dá)研究[9]。螢光素酶是一類生物發(fā)光酶，1種細(xì)胞可同時被2種具有不同底物的螢光素酶標(biāo)記。例如其一可由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動子驅(qū)動，作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化；另一螢光素酶由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動，其發(fā)光信號的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反映特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達(dá)活性[10－11]。

2．1．1腫瘤及抗腫瘤研究在體生物發(fā)光成像技術(shù)可直接實時地監(jiān)測各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實時觀測和評估，能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。Klerk等[12]研究證實了利用此技術(shù)測量腫瘤負(fù)荷具有很高的可靠性。Minn等[13]應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行了乳腺癌肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究，他們構(gòu)建能夠表達(dá)熒光蛋白、螢光素酶的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染已獲得的不同亞群腫瘤細(xì)胞，先通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)篩選同一亞群內(nèi)具有相同轉(zhuǎn)染效果（穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白即熒光蛋白和螢光素酶，且水平一致）的細(xì)胞，并尾靜脈注射免疫缺陷小鼠，通過檢測生物發(fā)光的部位和大小，評價不同亞群腫瘤細(xì)胞向肺部位的轉(zhuǎn)移情況及其轉(zhuǎn)移能力，再通過檢測細(xì)胞內(nèi)各基因的表達(dá)差異來分析肺轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。Gupta等[15－16]又用相似的方法來研究乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中分化基因介導(dǎo)的腫瘤再起始，結(jié)果再次顯示了生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用于腫瘤及癌轉(zhuǎn)移機理研究領(lǐng)域的優(yōu)越性。

2．1．2抗腫瘤免疫及腫瘤細(xì)胞疫苗的研究用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞或基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗，可以檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，并可尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機制。Cayeux等[17]用螢光素酶基因標(biāo)記基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗來免疫小鼠，而用另一種底物不同于前者的5，6－carboxy－succinimidyl－fluorescein標(biāo)記該小鼠內(nèi)一種與腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞，通過2種不同的標(biāo)記研究了基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗免疫小鼠后抗原遞呈、免疫細(xì)胞之間的相互作用及不同免疫細(xì)胞在體內(nèi)免疫過程中的作用。

2．1．3藥物促腫瘤細(xì)胞凋亡的研究當(dāng)螢光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無螢光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase－3在特異識別位點切去抑制多肽，螢光素酶活性得到恢復(fù)，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。細(xì)胞凋亡時被激活的caspase－3／7與DEVD－氨基螢光素（aminoluciferin）特異結(jié)合而被酶解為氨基螢光素，它可被螢光素酶識別而產(chǎn)生生物發(fā)光信號。Liu、Hickson等[18－19]利用這一現(xiàn)象設(shè)計的細(xì)胞凋亡檢測方法均能夠以極低的DEVD－氨基螢光素量獲得較強的發(fā)光強度，因而這一方法可用于評價TNFα（α腫瘤壞死因子）、FasL、TRAIL（TNF相關(guān)促凋亡配體）等因素針對腫瘤的治療效果。

2．1．4胚胎干細(xì)胞及再生醫(yī)學(xué)的研究胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極具應(yīng)用前景，然而注入活機體的胚胎干細(xì)胞及其分化細(xì)胞尚存在顯著的細(xì)胞死亡、畸胎瘤的形成、宿主免疫排斥反應(yīng)等障礙。應(yīng)用在體生物發(fā)光成像技術(shù)，可對胚胎干細(xì)胞本身及其在注入機體后的存活、增殖、分化等生物事件的發(fā)生機理進(jìn)行深入研究，從而使上述諸多問題得以解決[20]。

2．2標(biāo)記病原微生物，用于研究感染致病機制、轉(zhuǎn)移途徑及宿主免疫反應(yīng)等

在感染性疾病的研究中，在體生物發(fā)光成像技術(shù)的應(yīng)用，不僅可以提供疾病進(jìn)程中觀測病原體在動物體內(nèi)的寄居部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)等實時變化信息，而且更有助于揭示感染體內(nèi)病原體逃逸宿主防御的機制[21]。對病原體感染過程非侵入性的檢測能夠?qū)膊∵M(jìn)程實時地提供新的信息，且有可能發(fā)現(xiàn)新的感染位點[22]。Lucker等[23－26］以螢光素酶基因標(biāo)記HSV－1（單純皰疹病毒）并分別侵染Ⅰ類干擾素受體缺失、Ⅱ類干擾素受體缺失、Ⅰ和Ⅱ類干擾素受體均缺失的小鼠，可觀察到HSV－1對不同干擾素受體缺失小鼠的肝臟、肺、脾、淋巴結(jié)的侵襲，及病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過程，從而證實了不同干擾素在HSV－1感染中所起的不同的作用。Lucker等[27]針對痘苗病毒的類似研究也證實，不同干擾素在機體感染過程中各自和協(xié)同發(fā)揮的重要作用。#p#分頁標(biāo)題#e#

2．3標(biāo)記于基因治療載體用于探究基因治療機制和評價治療效果

將一個或多個目的基因安全有效地轉(zhuǎn)入體內(nèi)靶細(xì)胞可用于基因治療，應(yīng)用螢光素酶基因作為報告基因構(gòu)建載體，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內(nèi)持續(xù)高效和特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點。螢光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運輸和基因治療情況。Smith等[28]已經(jīng)運用該技術(shù)進(jìn)行了HSV作為肝臟疾病基因治療載體的可行性研究。Chou等[29]將帶有螢光素酶基因標(biāo)記的穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞癌抗原的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入沙門菌減毒株，并作為疫苗口服免疫模型小鼠，在體成像顯示了體內(nèi)沙門菌成功表達(dá)抗原和沙門菌作為活菌疫苗在體內(nèi)的清除過程。

2．4蛋白質(zhì)間相互作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的研究

蛋白片段互補策略廣泛用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)間的相互作用，這種策略在借助在體生物發(fā)光成像技術(shù)后就可以被運用到活體動物內(nèi)，以非侵入、可量化、實時地顯示蛋白質(zhì)之間的相互作用[31]。在動物體內(nèi)直接觀察細(xì)胞中或活體動物體內(nèi)2種蛋白質(zhì)的相互作用，可將Firefly螢光素酶（Fluc）的N端與C端分離開，分別與2個可能產(chǎn)生相互作用的目的蛋白相連，并使2組蛋白由不同的載體分別誘導(dǎo)表達(dá)。在體的細(xì)胞內(nèi)若2個目的蛋白能靠近并結(jié)合形成完整的Fluc，則會產(chǎn)生發(fā)光信號。Andrea等[32]建立了一種轉(zhuǎn)基因報告小鼠，由特異啟動子（TgG4F（＋／－））及其轉(zhuǎn)錄反式作用因子多聯(lián)體蛋白Gal4進(jìn)行調(diào)控。將融合了Gal4BD的p53和融合了VP16的TAg的病毒載體共轉(zhuǎn)入該小鼠的肝臟細(xì)胞，在小鼠肝臟部位觀察到了明顯的發(fā)光信號，顯示p53與TAg的結(jié)合引發(fā)Gal4BD與VP16結(jié)合，結(jié)合的多聯(lián)蛋白順利與啟動子TgG4F（＋／－）結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)Fluc在肝臟組織的表達(dá)。

2．5體內(nèi)干擾RNA及DNA疫苗的研究

目前RNA干擾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種體外轉(zhuǎn)錄后沉默基因的方法，在體內(nèi)RNA干擾的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)沉默可以引起各種廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，因此生物發(fā)光在體成像技術(shù)有力地促進(jìn)了體內(nèi)RNA干擾的研究和在體內(nèi)利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行其他疾病機理及生物治療的探索。McCaffrey[33]等通過將表達(dá)螢光素酶的真核表達(dá)載體與針對螢光素酶基因設(shè)計的雙鏈小干擾RNA（siRNA）共注射成年小鼠，與對照組比較，前者的熒光強度明顯減弱，表明針對性的雙鏈siRNA明顯起到抑制基因表達(dá)的作用。他們還構(gòu)建表達(dá)功能性小發(fā)夾RNA（shRNA）的真核表達(dá)載體，與表達(dá)螢光素酶的載體共注射成體小鼠，與對照組相比，同樣觀察到長時程后熒光強度明顯減弱。RNA干擾技術(shù)成功用于臨床治療須保證雙鏈siRNA有效轉(zhuǎn)入體內(nèi)并維持有效的濃度，而借助在體生物發(fā)光成像技術(shù)則可便捷準(zhǔn)確地評價雙鏈siRNA運送方法的效果。Takeshita等[34－36]已利用該技術(shù)分別對各自所設(shè)計的不同的雙鏈siRNA運送方法進(jìn)行了全面的評價，并發(fā)現(xiàn)合理的運送方法，如雙鏈siRNA與某些小分子化合物的連接修飾與單獨的注射雙鏈siRNA相比，前者能使雙鏈siRNA在體內(nèi)較長時間內(nèi)不被降解。RNA干擾可作為傳統(tǒng)DNA疫苗的補充，被用以在體內(nèi)消除免疫抑制因子表達(dá)。DNA疫苗的效應(yīng)常常因相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下調(diào)該獲得性免疫反應(yīng)而受到限制。因此，免疫抑制性的信號途徑的沉默將是DNA疫苗效能得到加強的一種極有潛力的策略。Huang等[37]應(yīng)用在體生物發(fā)光技術(shù)所做的研究結(jié)果顯示，皮下注射編碼shRNA的DNA，可以作為體內(nèi)基因沉默和一種能夠有效提高DNA疫苗效果的手段。

2．6標(biāo)記于轉(zhuǎn)基因載體建立轉(zhuǎn)基因動物模型

2．6．1基因表達(dá)動物模型為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達(dá)的，可將螢光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)及其他生物事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。Chen等[37]將受胰島素調(diào)控啟動子調(diào)控表達(dá)螢光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠制成糖尿病小鼠模型，采用在體生物發(fā)光成像技術(shù)證實了肝臟組織中含有可生成胰島素的細(xì)胞。研究結(jié)果也證實了在轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和反式轉(zhuǎn)錄因子與目的基因相同的情況下，螢光素酶的表達(dá)水平及底物發(fā)光強度能夠真實反映目的基因的表達(dá)狀況。目前對于調(diào)控多藥耐藥性基因－1（mdr－1a）表達(dá)的關(guān)鍵因子和胞內(nèi)微環(huán)境的機制尚不明了，使多藥耐藥性依然成為對癌癥患者成功化療的一大障礙。為深入研究mdr－1a在體內(nèi)組織中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制，Long等[38]通過胚胎干細(xì)胞同源重組、遺傳雜交的手段構(gòu)建了基因型為mdr－1a＋／Fluc的轉(zhuǎn)基因小鼠（野生型基因型為mdr－1a＋／＋）。mdr－1a＋／Fluc中Fluc已完全置于mdr－1a開放讀碼框中，其表達(dá)受內(nèi)源性mdr－1a啟動子及相應(yīng)各種反式作用因子的調(diào)控，Western印跡等不同方法均驗證了該模型mdr－1a的表達(dá)量與Firefly螢光素酶蛋白表達(dá)、發(fā)光強度成正比。該小鼠體內(nèi)Fluc的表達(dá)與mdr－1a的表達(dá)在時間、所處的微環(huán)境均完全一致，可作為研究各種因素下mdr－1a表達(dá)調(diào)控的理想的動物模型。類似的研究所建立的模型能彌補體外細(xì)胞培養(yǎng)不能提供的特定基因表達(dá)的真實微環(huán)境的缺點，也能彌補基因敲除小鼠存在的代償效應(yīng)等不足[39]。

2．6．2各種疾病模型研究者根據(jù)研究目的，將致病基因、病毒及細(xì)菌進(jìn)行螢光素酶標(biāo)記，轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等。除可提供靶基因在體內(nèi)的實時表達(dá)和對候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來評估候選藥物和其他化合物的毒性，為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。Hsieh[40－41]等將受前列腺特異性抗原啟動子調(diào)控表達(dá)螢光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠（sPSA－Luc），與前列腺癌轉(zhuǎn)基因模型小鼠TRAMP雜交，經(jīng)檢測篩選得到的子代小鼠TRAMP－Luc隨前列腺特異性抗原的表達(dá)穩(wěn)定產(chǎn)生螢光素酶。因此，該小鼠借助在體生物發(fā)光成像技術(shù)已被成功地用于前列腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移研究。

3在體生物發(fā)光成像技術(shù)的發(fā)展趨勢

近年來針對生物發(fā)光成像過程的三大要素，即螢光素酶、底物、成像設(shè)備的研究不斷取得新進(jìn)展。研究人員應(yīng)用遺傳學(xué)手段，在基因、蛋白水平對各種螢光素酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，獲得了新的螢光素酶，使底物發(fā)光的波長發(fā)生明顯的紅移（使發(fā)光波長變長）從而減少了光穿透機體組織時的光吸收，提高了螢光素酶在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的穩(wěn)定性，改變了酶在組織細(xì)胞中的半衰期。與原先的天然螢光素酶相比，通過改進(jìn)得到的各種螢光素酶在體內(nèi)表達(dá)的穩(wěn)定性、催化底物的反應(yīng)等方面得到了優(yōu)化，不僅增加了發(fā)光輸出量，更能適應(yīng)不同時程的成像方式[42－46]。各種螢光素酶與體內(nèi)不同組織對應(yīng)著獨特的動力學(xué)特征。研究人員試圖通過優(yōu)化發(fā)光底物轉(zhuǎn)入體內(nèi)的方式、底物在體內(nèi)的釋放方式、對細(xì)胞內(nèi)底物攝入相關(guān)蛋白加以限制，以及對底物本身的結(jié)構(gòu)加以改造等手段，來滿足體內(nèi)不同時程生物過程的動態(tài)性研究。Kheirolomoom等[47]分別用長循環(huán)脂質(zhì)體和溫度敏感型脂質(zhì)體包裹螢光素并轉(zhuǎn)入體內(nèi)。前者螢光素酶以一定水平正常表達(dá)時發(fā)光完全依賴于體內(nèi)螢光素的釋放。今后，通過選擇合適的包裹材料（如設(shè)計合理的脂質(zhì)體）或其他運載方式（如植入性微滲透泵[48]），可能使底物在體內(nèi)較長時間內(nèi)保持相對恒定的釋放速率，使底物濃度保持穩(wěn)定。#p#分頁標(biāo)題#e#

這樣，發(fā)光強度在一定時間內(nèi)完全取決于螢光素酶的表達(dá)水平。而溫度敏感型脂質(zhì)體可以被直接運到腫瘤組織中，通過一次超聲熱處理，可以引發(fā)一次爆發(fā)式快速釋放，這種溫度敏感型脂質(zhì)體則可以實現(xiàn)定點轉(zhuǎn)入和定點釋放底物。螢光素酶底物進(jìn)入細(xì)胞的過程受細(xì)胞內(nèi)某些自身蛋白的影響。Zhang等[49]發(fā)現(xiàn)ABC家族的乳腺癌耐性蛋白（ABCG2／BCRP）作為重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，其表達(dá)水平和特異結(jié)構(gòu)域的功能影響螢光素的攝入過程，因而影響生物發(fā)光信號的產(chǎn)出。這就提示，一方面可通過降低或消除此類蛋白對底物進(jìn)入靶細(xì)胞的影響，使發(fā)光信號相對地最大化，另一方面可被用于高效篩選針對ABCG2／BCRP的藥物抑制劑[50]。從某些細(xì)菌得到的螢光素酶基因均位于一個操縱子內(nèi)，且操縱子內(nèi)除含有螢光素酶基因外，還包含整套底物合成酶基因，因此，將該操縱子穩(wěn)定轉(zhuǎn)入的細(xì)菌侵染動物模型后，無需外源底物就能實現(xiàn)成像[51]。若將這類細(xì)菌來源的螢光素酶應(yīng)用于動物細(xì)胞，可能更有利于在體發(fā)光成像。但這是否可行，目前尚未見相關(guān)報道。成像設(shè)備方面的進(jìn)展不僅提高了設(shè)備的靈敏度，而且使功能更加全面，數(shù)據(jù)采集與分析更加精確。例如，已經(jīng)應(yīng)用三維成像技術(shù)使信號定位更明確、分析更全面。隨著在體生物發(fā)光成像技術(shù)的逐步成熟，必將使其更廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究的各領(lǐng)域。