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基因工程載體的種類范文1
筆者根據(jù)課標(biāo)要求，結(jié)合考綱和近年高考考點(diǎn)將近年基因工程考點(diǎn)總結(jié)如下。
一、 基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)
基因工程的理論鋪墊――分子生物學(xué)發(fā)展：
① 艾弗里證明了DNA是遺傳物質(zhì)。
② 沃森和克里克證明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。
③ 尼侖貝格破譯了遺傳密碼。
二、 酶切
基因工程選擇限制性內(nèi)切酶作為工具，主要是因?yàn)樗哂斜纫话忝父叩膶Ｒ恍浴Ｓ捎谄渚哂休^高的專一性，因此在基因工程的具體操作中如何選擇限制性內(nèi)切酶是高考的重點(diǎn)考察內(nèi)容。
1. 限制酶的特異性
例1 判斷用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸是否可行？_____。
答案 不可行
解析 限制酶的專一性非常強(qiáng)，其特異性表現(xiàn)在三個(gè)方面：識(shí)別DNA、識(shí)別特定序列（回文）、切割特定位點(diǎn)磷酸二酯鍵。由于煙草花葉病毒是RNA病毒，所以限制酶不能識(shí)別RNA。
另外要特別注意限制酶切割以后的結(jié)果，磷酸二酯鍵斷裂，暴露出新的磷酸基團(tuán)。
2. 限制酶的選擇
正確選擇限制酶是基因工程中一件非常重要的任務(wù)。限制酶的選擇應(yīng)當(dāng)遵循以下一些原則：不破壞目的基因；不破壞標(biāo)記基因；目的基因和運(yùn)載體上都有限制酶的切割位點(diǎn)。當(dāng)然也要注意用一種限制酶和兩種限制酶切割的區(qū)別。
例2 與只使用EcoR I相比較，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止_________
______________________。
答案 質(zhì)粒和含目的基因的外源DN段自身環(huán)化
解析 基因工程中目的基因和質(zhì)粒可以用同一種酶切，也可以用兩種酶切，若用一種酶切，質(zhì)粒只要切一個(gè)切口，目的基因需要切兩個(gè)切口；若用兩種酶切，質(zhì)粒要切兩個(gè)切口，目的基因也需要切兩個(gè)切口。一種酶切出的4個(gè)切口都相同，所以有多種連法，兩種酶切出的質(zhì)粒和目的基因上的4個(gè)切口兩兩相同，因此可以防止自身環(huán)化。
3. 同尾酶
限制酶種類多樣，一些酶之間關(guān)系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ識(shí)別不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它們切出的末端可以連接，被稱為同尾酶。
例3 已知限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GATC―。根據(jù)下圖示判斷下列操作正確的是（ ）
A. 質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割
D. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割
答案 A
三、 連接
1. 連接物類型
經(jīng)過(guò)限制酶切割過(guò)以后，暴露出的相同的黏性末端可以自動(dòng)連接，考生同時(shí)需要考慮：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因兩端的兩個(gè)黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；質(zhì)粒上的兩個(gè)黏性末端。綜合以上結(jié)論，連接產(chǎn)物的類型可能就比較多，如目的基因-目的基因連接物、目的基因-運(yùn)載體連接物、運(yùn)載體-運(yùn)載體連接物、其他DN段-運(yùn)載體連接物、目的基因自連、運(yùn)載體自連，若用同一種酶切時(shí)后兩種連接物不存在。
2. 連接酶
下表簡(jiǎn)要總結(jié)了基因工程中常見酶的特性差異。
例 PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開____________
___________________。
答案 DNA聚合酶只能將單核苷酸連接到雙鏈DN段的引物鏈上
解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么連接酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因?yàn)檫B接酶必須將兩段DNA相連。RNA聚合酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因?yàn)镽NA聚合酶雖然不要引物，但其不能催化T參與反應(yīng)，只能利用U。雖然這些酶都是催化磷酸二酯鍵，但它們作用的底物差異較大，所以一定要注意辨析。
以上主要介紹了基因工程的三種操作工具，這些內(nèi)容當(dāng)然是高考的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。除此之外有些內(nèi)容也應(yīng)當(dāng)給予一定關(guān)注，如：目的基因的獲取；目的基因的擴(kuò)增（PCR）；土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因的導(dǎo)入；重組質(zhì)粒的篩選；目的基因的檢測(cè)；轉(zhuǎn)基因生物的安全性；轉(zhuǎn)基因生物的利用等問題。
鞏固訓(xùn)練
1. 目前人類利用基因工程的方法成功培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，以下說(shuō)法正確的是
（ ）
A. 標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因
B. 抗蟲基因?qū)朊藁ㄈ~肉細(xì)胞后，可通過(guò)傳粉、受精的方法，使抗蟲性狀遺傳下去
C. 蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白基因與質(zhì)粒結(jié)合后直接進(jìn)入棉花的葉肉細(xì)胞表達(dá)
D. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉經(jīng)過(guò)種植，棉鈴蟲不會(huì)產(chǎn)生抗性，這樣可以有效消滅棉鈴蟲
2. 下圖四種質(zhì)粒含有E1和E2兩種限制酶的識(shí)別，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四環(huán)素的抗性基因。
（1） 將兩端用E1切開的Tcr基因與用E1切開的質(zhì)粒X-1混合連接，連接后獲得的質(zhì)粒類型有______。（可多選）
A. X-1 B. X-2
C. X-3 D. X-4
（2） 若將上圖所示X-1、X-2、X-3、X-4四種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，然后分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)上均不能生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞類型有____________、____________。
（3） 如果X-1用E1酶切，產(chǎn)生850對(duì)堿基和3 550對(duì)堿基兩種片段：那么質(zhì)粒X-2（Tcr基因的長(zhǎng)度為1 200對(duì)堿基）用E2酶切后的片段長(zhǎng)度為______對(duì)堿基。
（4） 若將外源的Tcr基因兩端用E2切開，再與用E2切開的X-1混合連接，并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果顯示，含X-4的細(xì)胞數(shù)與含X-1的細(xì)胞數(shù)之比為13，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________
________________________。
3. 下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，圖l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。請(qǐng)回答下列問題：
（1） 將提取的質(zhì)粒與外源DNA分別加入緩沖液中，選用相應(yīng)的限制酶處理時(shí)，影響處理效果的外界因素主要是______等（寫出兩點(diǎn)）。
（2） 用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，能否使用MspⅠ與BamHⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒與外源DNA？答：______，原因是______
___________________________。
（3） 可選用______（兩種）限制酶同時(shí)酶切質(zhì)粒與外源DNA，酶切并連接后可獲得______種含目的基因的重組質(zhì)粒，篩選含有該重組質(zhì)粒的大腸桿菌時(shí)，需要在含______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
（4） 為了從基因文庫(kù)中分離獲取T2噬菌體抗性基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入對(duì)T2噬菌體敏感的大腸桿菌，然后將含有該大腸桿菌的菌液分別接種在預(yù)先涂有______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而初步檢測(cè)目的基因的表達(dá)。
答案
1. A 2. （1） ABC
（2） 無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞 含X-3的細(xì)胞
（3） 4 750
（4） 不能 DNA連接酶對(duì)DN段沒有選擇性或者DNA末端相同
3. （1） 溫度、pH
（2） 不能 MspⅠ會(huì)切割質(zhì)粒上的兩個(gè)標(biāo)記基因，而BamHⅠ會(huì)切割破壞目的基因
基因工程載體的種類范文2
關(guān)鍵詞植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應(yīng)用;存在問題;展望
葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細(xì)胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進(jìn)入子代細(xì)胞;1909年baur和correns通過(guò)在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對(duì)葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來(lái)越重要的意義。
1葉綠體基因工程概述
1.1葉綠體簡(jiǎn)介
葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細(xì)胞器,能夠進(jìn)行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長(zhǎng)120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個(gè)反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個(gè)大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個(gè)小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。
1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)
葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、便于遺傳的特點(diǎn),故相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞核遺傳更能高效表達(dá)目的基因,這是因?yàn)槿~綠體基因本身?yè)碛芯薮蟮目截悢?shù)[3]。葉綠體基因可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達(dá)具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對(duì)植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點(diǎn),可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時(shí)間。
1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程
葉綠體轉(zhuǎn)化過(guò)程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過(guò)基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達(dá)框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細(xì)胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。
1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法
依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過(guò)程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對(duì)重組葉綠體進(jìn)行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標(biāo)記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過(guò)與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達(dá)。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標(biāo)記基因、同源片斷、啟動(dòng)子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。
2葉綠體基因工程的應(yīng)用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太陽(yáng)能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過(guò)2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過(guò)程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費(fèi)的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過(guò)提高rubisco酶來(lái)提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點(diǎn)整合試驗(yàn)取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價(jià)值的方法。
2.2合成有機(jī)物質(zhì)
由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點(diǎn),已被越來(lái)越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機(jī)物質(zhì)的可靠場(chǎng)所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達(dá)聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細(xì)菌的碳源及能源儲(chǔ)備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過(guò)構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達(dá)盒的葉綠體整合及表達(dá)載體,通過(guò)基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點(diǎn)雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。
2.3生產(chǎn)疫苗
人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)效率取決于外源基因的整合位點(diǎn),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國(guó)昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達(dá),且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進(jìn)行表達(dá),為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達(dá)的可行性,他們將基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,分別表達(dá)了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達(dá)量分別為總可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報(bào)道bt表達(dá)量達(dá)46.1%。在抗逆性方面,人們通過(guò)編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力。
2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用
葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點(diǎn):一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個(gè)較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價(jià)值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來(lái)解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來(lái)越多的葉綠體dna被用作分子標(biāo)記來(lái)研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來(lái)獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來(lái)面目。
2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景
當(dāng)今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過(guò)花粉的擴(kuò)散,產(chǎn)生超級(jí)雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對(duì)環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核轉(zhuǎn)化作物,因?yàn)榇蠖鄶?shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對(duì)基因污染的憂慮。
3葉綠體基因工程存在的問題
3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題
由于高等植物的每個(gè)細(xì)胞中有10~100個(gè)葉綠體,每個(gè)葉綠體內(nèi)有10~100個(gè)葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。
3.2植物的種類有待擴(kuò)展
可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無(wú)法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點(diǎn)。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過(guò)有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實(shí)的植物。
4展望
雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點(diǎn),科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進(jìn)行。為此,尋找更多更加合適的方法來(lái)改進(jìn)葉綠體基因工程,使其優(yōu)點(diǎn)更加明顯,必將在未來(lái)生物技術(shù)領(lǐng)域帶來(lái)又一場(chǎng)革命,為人類造福。
5參考文獻(xiàn)
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基因工程載體的種類范文3
一、種類
根據(jù)抗原性質(zhì)可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗；根據(jù)疫苗功效則可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。
1. 滅活疫苗。將分類離培養(yǎng)的病原微生物（多數(shù)為強(qiáng)毒株）用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑將其滅活但保留其免疫原性，與不同的佐劑混合后乳化制成滅活疫苗。目前，用于制備滅活疫苗的佐劑有礦物油佐劑和氫氧化鋁佐劑。前者多用于病毒性疫苗，如當(dāng)前使用的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、偽狂犬病毒滅活疫苗；用氫氧化鋁作為佐劑制備疫苗靜置后，會(huì)出現(xiàn)分層，疫苗在使用前搖勻即可，該佐劑多用于細(xì)菌疫苗。蜂膠佐劑多用于細(xì)菌苗和亞單位疫苗。
滅活疫苗的用途：①新分離的病原，短期內(nèi)難以致弱。如高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗和兔瘟滅活疫苗。②血清型較多的病原，疫苗的保護(hù)力呈現(xiàn)血清型特異性，如豬胸膜肺炎放線桿菌（15 個(gè)血清型）、副豬嗜血桿菌（15 個(gè)血清型）、豬鏈球菌（35 個(gè)血清型）等。③變異頻率高的病原，如新分離的口蹄疫M(jìn)ya-98 株。
豬用滅活疫苗中，有豬偽狂犬病滅活疫苗、豬口蹄疫0 型（單價(jià)/ 二價(jià)/ 三價(jià)）滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、豬細(xì)小病毒滅活疫苗、豬乙腦滅活疫苗、豬鏈球菌病單價(jià)( 二價(jià)/ 三價(jià)) 滅活疫苗、副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗和豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗等。
滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性強(qiáng)，疫苗毒株無(wú)毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；多數(shù)疫苗的免疫接種效果不受仔豬母源抗體水平高低的干擾；貯存條件方面，一般需冷藏保存，不能冷凍。其缺點(diǎn)是需要免疫次數(shù)多，接種后局部反應(yīng)略大，甚至出現(xiàn)接種部位污染，可引起局部炎癥膿腫，影響接種效果，也降低局部的肉品質(zhì)量。
2．弱毒活疫苗。
疫苗種類指將毒力下降或毒力完全喪失的病原微生物，與牛奶、明膠等佐劑混合后經(jīng)過(guò)低溫凍干后形成的疏松狀制劑。嚴(yán)格意義上，此類疫苗不包含采用基因工程方法對(duì)基因組改變后引起致病性改變的微生物制備的弱毒疫苗。根據(jù)所含的疫苗毒株分類不同，可以分為以下幾種：（1）細(xì)菌活疫苗：如仔豬副傷寒疫苗，豬丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。（3）豬支原體肺炎活疫苗。預(yù)防豬寄生蟲的活疫苗尚未問世。
我國(guó)常用的弱毒活疫苗較多，如豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬乙肝疫苗、豬丹毒活疫苗、豬肺疫活疫苗、仔豬副傷寒疫苗、豬馬腺疫鏈球菌活疫苗等。
活疫苗的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是：（1）免疫途徑多樣：可通過(guò)肌肉注射、滴鼻、口服等途徑免疫。（2）刺激產(chǎn)生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途徑免疫后可刺激機(jī)體產(chǎn)生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在預(yù)防呼吸道感染和消化道感染中具有獨(dú)特的作用，這是滅活疫苗無(wú)法比擬的，如沙門氏菌口服可以刺激機(jī)體腸道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效果較為確實(shí)。（4）免疫次數(shù)少于滅活疫苗。（5）接種后局部反應(yīng)低。缺點(diǎn)：受母源抗體的影響如豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗等；受抗菌藥物的影響如仔豬副傷寒弱毒疫苗、豬丹毒- 肺疫二聯(lián)弱毒疫苗和豬支原體弱毒疫苗等；活疫苗運(yùn)輸保存條件嚴(yán)格，需冷凍條件。
3. 基因工程疫苗。
利用分子生物學(xué)手段改造病原微生物的基因，獲得毒力下降、喪失的突變株或構(gòu)建以弱毒株為載體、表達(dá)外源基因的重組毒（菌）株，并利用它們作為疫苗毒株制備疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活載體疫苗。該疫苗與常規(guī)弱毒疫苗相比，主要區(qū)別在于后者采用常規(guī)技術(shù)，而非分子生物學(xué)技術(shù)，來(lái)致弱病原微生物，不確定其毒力致弱的分子機(jī)制。
作為基因工程疫苗載體的病毒或細(xì)菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、對(duì)靶動(dòng)物和非靶動(dòng)物是安全的，基因組龐大、可容納外源基因，并高效表達(dá)。常用的活載體有：偽狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙門氏菌弱毒菌株、乳酸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌弱毒株。我國(guó)在“十一五”期間，在“863”課題資助下，開展了以偽狂犬病毒為載體，表達(dá)豬細(xì)小病毒、乙腦病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因的研究。鑒于對(duì)其安全性的憂慮，我國(guó)規(guī)定轉(zhuǎn)基因生物（包含基因工程 疫苗）必須經(jīng)歷實(shí)驗(yàn)室和野外安全性觀察測(cè)試，獲得安全證書后，方能進(jìn)行疫苗學(xué)研宄，以申報(bào)獸用生物制品新獸藥證書。目前，我國(guó)己經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程疫苗有：豬偽狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、豬大腸桿菌K88-K99 基因工程疫苗。重組載體疫苗尚未正式上市。
4．核酸疫苗。
核酸疫苗產(chǎn)生于20 世紀(jì)80 年代。將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達(dá)載體中制備重組質(zhì)粒，這種質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，利用宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，合成該蛋白，剌激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞免疫和體液抗體，因而稱之為DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大腸桿菌大量制備，成本較低。針對(duì)細(xì)菌病、病毒病和寄生蟲病的DNA 疫苗報(bào)道較多。但基于是否整合到宿主染色體等安全性考慮，核酸疫苗多處于實(shí)驗(yàn)研宄階段，尚未大量應(yīng)用。RNA 疫苗是近幾年才出現(xiàn)的一種核酸疫苗，主要在人類醫(yī)學(xué)中，作為RNA 類藥物，用于抗腫瘤研宄。在動(dòng)物疫苗領(lǐng)域尚未見RNA 疫苗的應(yīng)用報(bào)道。
5. 亞單位疫苗與合成肽疫苗。
利用物理化學(xué)方法提純病原微生物中具免疫原性的組份，或者利用基因工程表達(dá)該組分，純化后加入佐劑而制成。豬傳染性胸膜肺炎的亞單位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供對(duì)所有15 個(gè)血清型的交叉保護(hù)力。我國(guó)使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有較強(qiáng)免疫原性的抗原片段，加入佐劑制成。該疫苗的優(yōu)點(diǎn)是抗原組分單一，純度高，免疫反應(yīng)強(qiáng)，副作用低；能迅速針對(duì)新出現(xiàn)變異毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本較高。
6．轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗。
將病原微生物中編碼免疫蛋白的基因插入植物基因組中，獲得表達(dá)病原微生物免疫原性的植物，再?gòu)闹参镏刑峒兊鞍子糜谧⑸鋭?dòng)物或?qū)⒅参镏苯语曃箘?dòng)物，產(chǎn)生免疫力。用于表達(dá)免疫原性基因的植物主要是馬鈴薯、玉米、蔬菜、番茄、煙草和香蕉等，稱為轉(zhuǎn)基因可飼疫苗（ediable vaccine)。此類疫苗在口蹄疫（擬南芥、苜蓿和馬鈴薯為受體)、豬傳染性胃腸炎（馬鈴薯、花椰菜和土豆為受體)、腹瀉（煙草為受體）和輪狀病毒感染（番茄和馬鈴薯為受體）等疾病防控中有研究的報(bào)道,但未見臨床應(yīng)用。目前的技術(shù)難題是：選擇直接生食和貯藏方便的植物作為表達(dá)植株（煙草不適用于動(dòng)物基因的篩選和優(yōu)化其密碼子和使用合適啟動(dòng)子，使其表達(dá)量滿足疫苗免疫劑量的要求；免疫劑量免疫程序的確定；并設(shè)法提高口服后黏膜免疫效果。轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗主要應(yīng)用在胃腸道疾病中。
二、疫苗使用的注意事項(xiàng)
1． 建立在正確的流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，有針對(duì)性選擇所需疫苗，不可盲從。對(duì)于多血清型菌株感染，應(yīng)選擇與當(dāng)?shù)亓餍芯暄逍鸵恢碌囊呙纾庖咝Ч_實(shí)。
2．確保疫苗運(yùn)輸和使用過(guò)程中的冷鏈保障。如疫苗的物理性狀己經(jīng)改變，如分層現(xiàn)象，不可用手工混勻后再使用，應(yīng)丟棄。
3．細(xì)菌活疫苗使用前后不可同時(shí)使用抗生素或有抗菌活性的中草藥。
4．建議使用于健康豬群；正在發(fā)病豬群使用緊急接種，可能會(huì)加快處于疾病晚期豬只死亡，但是會(huì)縮短豬群的病程，因此要有心理準(zhǔn)備。
5．制定合理的免疫程序，避免母源抗體干擾。不同疫苗接種之間至少間隔1 周。不同疫苗的同時(shí)混合使用，要先做小范圍的觀察，如無(wú)副反應(yīng)，再大群使用。
基因工程載體的種類范文4
1. 轉(zhuǎn)基因植物
轉(zhuǎn)基因作物的研究規(guī)模已達(dá)到了空前的水平。自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因抗病毒植物誕生以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的研制、中間試驗(yàn)、田間釋放和商業(yè)化種植得到了迅速的發(fā)展，到1997年底，轉(zhuǎn)基因植物已達(dá)幾百種；轉(zhuǎn)基因作物于1986年在美國(guó)和法國(guó)首次進(jìn)入大田試驗(yàn)，到1997年底全世界轉(zhuǎn)基因作物的田間試驗(yàn)已達(dá)25000多例；1994年，美國(guó)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因延熟番茄的商業(yè)化生產(chǎn)，到1997年底，全世界共有51種轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品被正式投入商品化生產(chǎn)。
轉(zhuǎn)基因作物的種植面積正在迅速擴(kuò)大。全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在1995年僅為1.2×106hm2，1996年為2.84×106hm2，1997年為1.25×107hm2，1998年為2.78×107hm2，1999年增至3.99×107hm2.2000年進(jìn)一步增至4.42×107hm2，2001年已達(dá)5.26×107hm2.2001年全球轉(zhuǎn)基因作物按作物種類統(tǒng)計(jì)為：大豆占46%，棉花占20%，油菜占11%，玉米占7%；按國(guó)家統(tǒng)計(jì)：美國(guó)占70%（面積，下同）、阿根廷占22%、加拿大占6%、中國(guó)占1%～3％，上述4國(guó)占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的99%；按目標(biāo)性狀分類：抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物占77%，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物占15%.據(jù)統(tǒng)計(jì)，1999年美國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆、棉花和玉米的種植面積，分別占該國(guó)相應(yīng)作物種植面積的55%、50%和30%。
轉(zhuǎn)基因作物具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，1997年美國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積為1×106hm2，平均增產(chǎn)70%，每公頃抗蟲棉可增加凈收益83美元，直接經(jīng)濟(jì)效益近1億美元；1998年美國(guó)種植轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米達(dá)5×106hm2，平均增產(chǎn)9%，其凈收益為68.1美元／hm2，可產(chǎn)生直接經(jīng)濟(jì)效益3.4億美元。1995年全球轉(zhuǎn)基因作物的銷售額僅為0.75億美元，1998年達(dá)到12億美元～15億美元，2000年已達(dá)30億美元，5年間增加了40倍。預(yù)計(jì)2005年將達(dá)60億美元，2010年將達(dá)到200億美元。
2.植物用轉(zhuǎn)基因微生物
自上世紀(jì)80年代以來(lái)，重組農(nóng)業(yè)微生物工程研究取得了突破性進(jìn)展，其中新型重組固氮微生物研究已進(jìn)入田間試驗(yàn)，一些殺蟲、防病遺傳工程微生物進(jìn)入田間試驗(yàn)或商業(yè)化生產(chǎn)。防凍害基因工程菌株已于1987年進(jìn)入田間試驗(yàn)，防治果樹根癌病工程菌株也于1991年和1992年先后在澳大利亞和美國(guó)獲準(zhǔn)登記，目前已在澳大利亞、美國(guó)、加拿大和西歐一些國(guó)家銷售，這是世界上首例商品化生產(chǎn)的植病生防基因工程細(xì)菌制劑。具有殺蟲活性的轉(zhuǎn)B.t基因工程細(xì)菌，自1991年起已有多個(gè)產(chǎn)品進(jìn)入市場(chǎng)。在高銨條件下仍保持良好固氮能力的耐銨工程菌株，也進(jìn)入田間試驗(yàn)。
3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面：改良動(dòng)物品種和生產(chǎn)性能；生產(chǎn)人藥用蛋白和營(yíng)養(yǎng)保健蛋白；生產(chǎn)人用器官移植的異種供體；建立疾病和藥物篩選模型；生產(chǎn)新型生物材料等。1998年全球動(dòng)物生物技術(shù)產(chǎn)品總銷售額約為6.2億美元，預(yù)計(jì)2010年總銷售額將達(dá)到110億美元，其中75億美元是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品。
4. 獸用基因工程生物制品
獸用基因工程生物制品是指利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的獸用免疫制劑。主要包括：?jiǎn)慰寺】贵w等診斷試劑，目前國(guó)內(nèi)外正在研究、開發(fā)或已應(yīng)用的單克隆抗體診斷試劑已達(dá)1000多種；基因工程疫苗，已有44例獲準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)，其中重組亞單位疫苗30例，基因缺失活疫苗12例，基因重組活疫苗2例。此外，還有DNA疫苗和獸用基因植物源生物制品等。
5. 轉(zhuǎn)基因水生生物
迄今為止，全世界研究的轉(zhuǎn)基因水生生物達(dá)20余種，已有8種進(jìn)入中間試驗(yàn)，其中我國(guó)有一種兩例，僅有大西洋鮭1種可能已開始小規(guī)模商品化生產(chǎn)。
6. 我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)化概況
我國(guó)轉(zhuǎn)基因植物的研究開發(fā)始于20世紀(jì)80年代，1986年啟動(dòng)的863高新技術(shù)計(jì)劃起到了關(guān)鍵性的導(dǎo)向、帶動(dòng)和輻射作用。據(jù)1996年統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)正在研究和開發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物約47種，涉及各類基因103種。1997年～1999年，有26例轉(zhuǎn)基因植物獲準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。按轉(zhuǎn)基因性狀分：抗蟲16例，抗病毒9例，改良品質(zhì)1例。按作物劃分：棉16例，番茄5例，甜椒4例，矮牽牛1例。
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是國(guó)內(nèi)植物基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的第一個(gè)成功范例，使我國(guó)成為繼美國(guó)之后獨(dú)立研制成抗蟲棉，并具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的第二個(gè)國(guó)家。1998年～2001年4年累計(jì)種植逾1.3×106hm2，減少農(nóng)藥使用量70%以上，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。由于其傘形輻射的帶動(dòng)作用，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、楊樹等一批后繼轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品正在進(jìn)行田間試驗(yàn)，蓄勢(shì)待發(fā)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將使農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)生深刻的結(jié)構(gòu)變化，向農(nóng)業(yè)與醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)與食品、農(nóng)業(yè)與加工結(jié)合的方向發(fā)展。
我國(guó)植物用轉(zhuǎn)基因微生物研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，正在研發(fā)的防病殺蟲微生物13種，涉及基因16種；固氮微生物8種，涉及基因12種，大多已進(jìn)入中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放試驗(yàn)。我國(guó)獸用基因工程生物制品研究與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展迅速，已有近70種單克隆抗體等診斷試劑投放市場(chǎng)，2例基因工程疫苗獲準(zhǔn)進(jìn)行商品化生產(chǎn)，其中重組亞單位疫苗1例，基因重組活疫苗1例。
我國(guó)轉(zhuǎn)基因水生生物研究取得了舉世矚目的成就，1985年，我國(guó)培育出世界首批轉(zhuǎn)基因魚。此后，培育出比正常生長(zhǎng)速度快3倍～4.6倍的轉(zhuǎn)基因泥鰍。目前，轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因鯉、轉(zhuǎn)大馬哈魚生長(zhǎng)激素基因鯉均進(jìn)入中試階段。此外，我國(guó)還開展了藻類、貝類等其他水生生物的轉(zhuǎn)基因研究。我國(guó)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究成績(jī)斐然，生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高、對(duì)某些病毒有一定抗性的轉(zhuǎn)基因豬培育成功，乳腺組織能夠表達(dá)人藥用蛋白凝血因子IX、人生長(zhǎng)激素、人紅細(xì)胞生成素的轉(zhuǎn)基因羊已進(jìn)入中試和安全性評(píng)價(jià)階段，此外，還成功地培育了轉(zhuǎn)基因牛。
基因工程載體的種類范文5
16.穩(wěn)態(tài)維持的三種調(diào)節(jié)機(jī)制:穩(wěn)態(tài)的實(shí)現(xiàn),是機(jī)體在神經(jīng)――體液――免疫調(diào)節(jié)下,各器官、系統(tǒng)協(xié)調(diào)活動(dòng)的結(jié)果。
17.人體免疫的三道防線:皮膚、黏膜是保衛(wèi)人體的第一道防線;體液中的殺菌物質(zhì)(如溶菌酶)和吞噬細(xì)胞是保衛(wèi)人體的第二道防線;第三道防線主要是由免疫器官和免疫細(xì)胞借助血液循環(huán)和淋巴循環(huán)而組成的特異性免疫系統(tǒng)。
18.特異性免疫的三個(gè)階段:感應(yīng)、反應(yīng)和效應(yīng)階段。
19.抗原的三個(gè)特點(diǎn):大分子性、特異性、異物性。
20.免疫異常的三種疾病:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡屬于自身免疫疾病;AIDS屬于免疫缺陷病;蕁麻疹屬于過(guò)敏反應(yīng)。
21.可遺傳變異的三個(gè)來(lái)源:基因突變、基因重組和染色體變異,共同為生物進(jìn)化提供了原材料。
22.基因工程的三種工具:限制酶、DNA連接酶和載體。
23.三種RNA:信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA和核糖體RNA。
24.人類遺傳病的三種主要類型:單基因遺傳病、多基因遺傳病和染色體異常遺傳病。
25.基因工程中載體的三個(gè)條件:①能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制;②有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切點(diǎn),以便與外源基因連接;③具有某些標(biāo)記基因,以便進(jìn)行篩選。
26.物種形成的三個(gè)環(huán)節(jié):突變和基因重組產(chǎn)生生物進(jìn)化的原材料;自然選擇決定生物進(jìn)化的方向;隔離導(dǎo)致物種的形成。
27.常用的誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的三種因素:聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒和電刺激。
28.細(xì)胞融合的三種可能:A型與B型細(xì)胞可能發(fā)生同種或異種細(xì)胞的融合,形成AA型、BB型、AB型的融合細(xì)胞。
29.年齡組成的三種類型:增長(zhǎng)型、穩(wěn)定型和衰退型。
30.生態(tài)系統(tǒng)的三個(gè)基本功能:物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息流動(dòng)。
31.受精作用時(shí),穿越的三重結(jié)構(gòu):依次為卵細(xì)胞的放射冠、透明帶和卵黃膜。
基因工程載體的種類范文6
1.1細(xì)菌素
乳酸菌的細(xì)菌素本質(zhì)為蛋白質(zhì),可以當(dāng)作防腐劑容易被胃酶講解,擁有相對(duì)較好的理化與抑菌特點(diǎn)。當(dāng)前,nisin與microgard已經(jīng)運(yùn)用在乳食產(chǎn)品防腐劑中。nisin作為乳酸乳球菌亞種的一項(xiàng)分泌肽,大量的革蘭氏陽(yáng)性菌與少量的革蘭氏陰性菌具備一定的抑制作用。在上世紀(jì)中期nisin主要用在對(duì)芽孢生長(zhǎng)菌成長(zhǎng)的控制與有效延長(zhǎng)乳制品等的貨架期。目前,FDA已經(jīng)通過(guò)有關(guān)部門批準(zhǔn)可以運(yùn)用在融化干酪相關(guān)抗菌劑。除去當(dāng)作食品的防腐劑之外,nisin可以當(dāng)作醫(yī)療制劑運(yùn)用在牛炎的治療中。另外,microgard還是一種具備抑制性的革蘭氏陰性菌與真菌細(xì)菌素,可是其不能抑制革蘭氏的陽(yáng)性菌。例如美國(guó)的1%microgard溶液普遍運(yùn)用在保存鄉(xiāng)村干酪。同時(shí)microgard能夠有效控制瑞士干酪皮的出現(xiàn)的腐敗問題。運(yùn)用定點(diǎn)突變的作用,例如蛋白質(zhì)相關(guān)生物工程技術(shù)能夠有效拓寬細(xì)菌素相關(guān)狹窄的抑菌普。現(xiàn)階段,已能夠克隆與測(cè)序nisin形成的相關(guān)基因,可以實(shí)現(xiàn)定位在質(zhì)拉或是染色體DNA中編碼等的克隆與測(cè)序。大量細(xì)菌素基因可以定位于接合質(zhì)粒或是轉(zhuǎn)座子上,比較便于基因轉(zhuǎn)移至其他相關(guān)微生物。
1.2促進(jìn)干酪成熟
干酪的成熟期相對(duì)較長(zhǎng),冷藏與庫(kù)存的費(fèi)用也比較高。對(duì)此,促進(jìn)干酪的成熟已經(jīng)成為干酪研究的主要內(nèi)容。促進(jìn)干酪成熟以往的手段主要是在其添加蛋白酶和肽酶以及脂肪酶等。目前,通常是在干酪中添加酶類和經(jīng)過(guò)基因工程技術(shù)修飾之后的如霉菌促進(jìn)干酪的成熟。許多學(xué)者都重點(diǎn)研究基因工程技術(shù)的乳酸菌修飾,能夠加速干酪的成熟,擁有相對(duì)良好的抗噬菌體能力。充分運(yùn)用蛋白質(zhì)的分解陰性等促進(jìn)干酪的成熟。另外,乳糖代謝之后的陰性乳酸菌能夠以高密度進(jìn)入干酪的凝乳當(dāng)中,促進(jìn)干酪的成熟。相對(duì)較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能夠有效加速苦味肽進(jìn)一步生成。對(duì)此,蛋白質(zhì)所分解的陰性菌體和一般菌株混合運(yùn)用可以有效促進(jìn)干酪的成熟。
2生物工程技術(shù)的育種手段
2.1原生質(zhì)體融合
原生質(zhì)體的融合技術(shù)作為創(chuàng)建雜合微生物的主要工具,其能夠把相對(duì)較好的菌株形狀有效結(jié)合在相同的菌株中,在乳酸菌的育種方面有著深遠(yuǎn)意義。在原生質(zhì)體的融合過(guò)程中,可以先運(yùn)用酶除去兩個(gè)親體的細(xì)胞壁,從而是使菌體細(xì)胞可以在高滲的環(huán)境當(dāng)中釋放原生質(zhì)體,同時(shí)在高滲環(huán)境下實(shí)現(xiàn)混合,然后通過(guò)聚乙二醇的促進(jìn),可以實(shí)現(xiàn)兩種原生質(zhì)體的凝集從而有效融合,獲取異核體或是重組子。充分運(yùn)用雜合菌能夠有效提升發(fā)酵制品特性或是發(fā)展新型產(chǎn)品。另外,原生質(zhì)體的融合技術(shù)可以建立高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相關(guān)突變體的主要方式。
2.2電穿孔法
在重組DNA技術(shù)快速發(fā)展形勢(shì)下,當(dāng)代微生物研究人員可以相對(duì)精確的變化乳酸菌的生理特性,從而為乳品的發(fā)酵項(xiàng)目提供較好的菌株。對(duì)此,一定要具備合理、安全、科學(xué)的細(xì)菌轉(zhuǎn)換手段。近些年來(lái),具備良好發(fā)展前景的轉(zhuǎn)換手段就是電穿孔法。在上世紀(jì),Harlander第一次報(bào)道了乳酸乳球菌的乳酸亞種的有關(guān)電轉(zhuǎn)化,該轉(zhuǎn)化率能夠和原生質(zhì)體融合的轉(zhuǎn)化率相比。另外Chassy與Flickinger也報(bào)道了干酪的乳桿菌有關(guān)干酪亞種電轉(zhuǎn)化。當(dāng)前成功完成電轉(zhuǎn)化的乳酸菌有多種,例如嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌的乳油亞種等。通過(guò)研究表明各種菌株之間也能夠完成電轉(zhuǎn)化。其和原生質(zhì)體的融合技術(shù)相比較而言具有一定優(yōu)勢(shì)。
2.3基因的送遞系統(tǒng)
在乳酸菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)快速發(fā)展影響下,建立基因的傳遞系統(tǒng)成為了必然趨勢(shì)。載體主要可以分成試驗(yàn)用載體與食品級(jí)載體兩大種類。充分考慮到食品的安全性與穩(wěn)定性,食品級(jí)的載體不能利用抗生素的抗性基因當(dāng)作選擇性的標(biāo)記。因此,食品在集體的選取一定要在食品級(jí)GRAS的菌中分離出選取性標(biāo)記。在進(jìn)行記載時(shí)所運(yùn)用的乳酸菌標(biāo)記主要有nisin的抗性基因合和胸苷酸合成的酶基因。另外,乳酸菌中所編碼的細(xì)菌素產(chǎn)生和糖類運(yùn)用或是免疫性基因可以滿足食品級(jí)基因相關(guān)傳遞系統(tǒng)的選擇性標(biāo)記要求。
3結(jié)語(yǔ)
