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凝膠色譜范文1
【關(guān)鍵詞】凝膠滲透色譜；農(nóng)藥殘留分析；全球經(jīng)濟(jì)一體化；監(jiān)測(cè)系統(tǒng)
1 引言
隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，健康問題已得到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注，食品安全問題也提上記事議程，環(huán)境的破壞和食品農(nóng)藥殘留問題不斷涌現(xiàn)，逐漸成為阻礙我國出口貿(mào)易發(fā)展的屏障。農(nóng)藥是一種農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可或缺的生產(chǎn)資料，在適量的條件下，對(duì)生存與農(nóng)業(yè)、林業(yè)和畜牧業(yè)之間的害蟲和細(xì)菌有積極的預(yù)防作用，也能在一定程度上促進(jìn)動(dòng)植物的生長，預(yù)防各種蟲害，為農(nóng)業(yè)的創(chuàng)收增產(chǎn)和預(yù)防傳染病方面有不可磨滅的突出作用。在有限的科技手段中，農(nóng)藥仍是預(yù)防疾病、增產(chǎn)創(chuàng)收、緩解糧食壓力的最快捷、最便利、最廉價(jià)、最有效的方法之一。可是，農(nóng)藥也不是面面俱到，農(nóng)藥的使用本身存在著巨大的隱患，由于我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的大量長期使用不僅污染土地和大氣，還造成生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重失衡，更嚴(yán)重的是，農(nóng)藥可殘留于食物中，使牲畜和人類中毒，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。然而，農(nóng)藥殘留的原因復(fù)雜繁多：使用了價(jià)格低廉，不易分解的農(nóng)藥；使用農(nóng)藥過量；畜牧業(yè)藥浴；在動(dòng)物即將宰殺前仍使用農(nóng)藥；飼養(yǎng)牲畜的飼料為受過農(nóng)藥污染的產(chǎn)品等。近日，農(nóng)藥殘留分析方法及檢測(cè)技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但食品分類復(fù)雜以及農(nóng)藥品種的化學(xué)性質(zhì)千差萬別，為農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)帶來了更大的挑戰(zhàn)。其中，農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理技術(shù)包含先進(jìn)的固相萃取技術(shù)、基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)、凝膠滲透色譜技術(shù)以及加速溶劑萃取技術(shù)等等。這些技術(shù)的功能特點(diǎn)不盡相同，有的是專門分析水源和土壤的，有的是分析果蔬的，有的是分析生物樣品的，而本文討論的凝膠滲透色譜技術(shù)在大分子樣品分離凈化脂肪、色素等方面有顯著效果。
2 凝膠滲透色譜技術(shù)
前處理和測(cè)定是農(nóng)藥殘留分析處理的主要手段，而分析的關(guān)鍵是樣品的前處理問題。凝膠滲透色譜技術(shù)大部分使用的是XAD系列的凝膠，其洗脫劑是配比不同的乙酸乙酯和環(huán)乙烷，將大小分子不同的多孔凝膠分離，把油脂、葉綠素、聚合物和生物堿等大分子物質(zhì)首先淋洗處理，分子質(zhì)小的后淋洗處理。然后將洗脫液收集起來再次進(jìn)行分析。凝膠滲透色譜分離的關(guān)鍵因素是柱填料，它分為有機(jī)凝膠和無機(jī)凝膠，這要求其必須具備強(qiáng)韌的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)惰性，還要有流動(dòng)性小，分離廣等特點(diǎn)。一般的分離方法有機(jī)溶劑消耗量極大，誤差也大，從而操作繁瑣，而凝膠滲透色譜技術(shù)分離樣品運(yùn)用物理方法分離蛋白質(zhì)脂肪，并且過程簡(jiǎn)單，誤差小。
2.1 凝膠滲透色譜技術(shù)的應(yīng)用原理
檢驗(yàn)農(nóng)藥殘留的方法頗多，目前主要有兩種____生化法和色譜法。生化法操作簡(jiǎn)單，測(cè)速快效率高。色譜法是使用色譜分離技術(shù)，選取合適的儀器測(cè)定農(nóng)藥殘留的方法，也是農(nóng)藥殘留檢測(cè)的常見方法。凝膠滲透色譜技術(shù)是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的技術(shù)，它可用于分析化學(xué)性質(zhì)相同但分子體積有差異的同系物質(zhì)。先用洗脫機(jī)把注射進(jìn)色譜柱中的預(yù)處理濃縮樣品洗脫分離完成，使樣品的形狀和分子大小各異，在通過固定凝膠直徑使大分子樣品首先被洗脫出來，小分子隨之被洗脫出來。凝膠滲透色譜是一項(xiàng)十分有發(fā)展前景的分子量測(cè)量方式的課題，從一開始的生物學(xué)向生化、高分子化學(xué)、無機(jī)化學(xué)等廣泛擴(kuò)展領(lǐng)域，可見其應(yīng)用范圍之廣泛，滲透領(lǐng)域之普遍，是農(nóng)藥殘留分析的關(guān)鍵性的凈化方法。
2.2 凝膠滲透色譜技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用
農(nóng)藥殘留分析同時(shí)需要靈敏度極高的檢測(cè)技術(shù)和操作精良的方式方法，其難點(diǎn)就是在除掉雜質(zhì)的時(shí)候保持較高的回收率。提取液的選擇要根據(jù)農(nóng)藥的極性來判斷，即極性弱的提取液配備極性小的有機(jī)氯農(nóng)藥。，而極性強(qiáng)的農(nóng)藥配備丙酮提取液。對(duì)于特殊的復(fù)雜基質(zhì)，如油脂較高的物質(zhì)常常不能使用較為普遍的液態(tài)萃取或者柱層凈化萃取法，使用凝膠滲透色譜技術(shù)則可以在柱填料和被分離式樣無相互作用的情況下按自身大小進(jìn)行自動(dòng)分離。值得欣慰的是，此技術(shù)完全可以在常溫下進(jìn)行，沒有可逆吸附，能使每一個(gè)凝膠滲透色譜技術(shù)的分離樣品完全洗脫。并且凝膠滲透色譜凈化法能夠排除大分子的干涉，對(duì)各種形態(tài)大小復(fù)雜的基質(zhì)都適用。
隨著科技的進(jìn)步，農(nóng)藥品種不斷增多，溶劑體系也不斷加強(qiáng)完善，Bio-Beads SX-3作為凝膠滲透體系的柱填材料也有迅猛發(fā)展。我們對(duì)凝膠滲透色譜技術(shù)在糧食中的應(yīng)用為例做簡(jiǎn)要的分析。糧食中包含脂肪，蛋白質(zhì)，淀粉等多種材料，這位提取農(nóng)藥殘留時(shí)排除干擾物進(jìn)入溶劑增加了困難，因此必須用合適的凈化手段對(duì)基質(zhì)的干擾進(jìn)行解除。將研究人員分為ABCD四個(gè)小組，A組用凝膠滲透色譜技術(shù)對(duì)糙米進(jìn)行凈化，對(duì)糙米中的有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯農(nóng)藥進(jìn)行分析時(shí)采用氣相色譜技術(shù)，測(cè)出的平均回收率約為80%-92%。B組還引用了新的氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，分析檢驗(yàn)了玉米中的三唑醇和三唑酮，結(jié)果為農(nóng)藥回收率大約為96%-115%。而C組使用凝膠滲透色譜技術(shù)凈化糙米，對(duì)其中可能存在的60多種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行殘留分析，其中35種農(nóng)藥回收率在65%-110%之間。D組用詞技術(shù)凈化和氣相色譜技術(shù)建立大豆中8種二硝基苯胺類除草劑的殘留分析方法，去除量很高。又如，運(yùn)用凝膠滲透色譜技術(shù)同樣能對(duì)水果蔬菜的農(nóng)藥殘留凈化起到積極作用。實(shí)驗(yàn)表明，運(yùn)用凝膠滲透色譜技術(shù)對(duì)果蔬進(jìn)行抽樣凈化，其中有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行分析的結(jié)果為回收率67%～105%。
2.3 凝膠滲透色譜技術(shù)的缺陷
運(yùn)用凝膠滲透色譜技術(shù)凈化的方法是利用分離大分子干擾雜質(zhì)，最終可將農(nóng)藥從基質(zhì)中脫離出來，其最終效果的如何與分子大小、形狀和阻礙情況有關(guān)。但其中也包含一些不可避免的問題。首先，分子分離可能不徹底，這是由于小分子可以被洗脫到農(nóng)藥里，可大分子極可能跟隨油脂先流出去，這時(shí)便需要使用柱色譜來凈化。其次，GPC所耗費(fèi)的溶劑量很大，這樣當(dāng)柱色譜內(nèi)直徑比較大時(shí)，處理較多樣品時(shí)速度就會(huì)減慢，消耗的能量也多。為了避免這一弊端，科學(xué)家研制出了自動(dòng)化的凝膠滲透色譜凈化儀，讓凈化柱更加趨向柱內(nèi)直徑小，載荷量大和體積小的進(jìn)樣發(fā)展，使其分離度得到改善，應(yīng)用范圍得以拓寬。第三，其限制的條件較多。基質(zhì)的選擇和情況對(duì)化合物的準(zhǔn)確定性和定量有較強(qiáng)的影響力，當(dāng)從事食品樣品的殘留分析時(shí)，必須考慮多種因素才能得到精確的結(jié)果，這要求我們既要對(duì)基質(zhì)反復(fù)評(píng)估又要通過有效途徑進(jìn)行消除和補(bǔ)償。
3 總結(jié)
凝膠滲透色譜技術(shù)目前已日臻成熟，其提取和凈化方法的研究和實(shí)驗(yàn)已十分常見，此方法除了農(nóng)藥外，還被廣泛運(yùn)用到藥材、甘藍(lán)、蜂蜜等成分的分析中，其在農(nóng)藥殘留方面的貢獻(xiàn)還要遠(yuǎn)大的發(fā)展前景。
參考文獻(xiàn)：
[1]趙子剛，王建，賈斌.凝膠滲透色譜-氣相色譜法檢測(cè)小麥中的24種農(nóng)藥殘留[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010（3）.
凝膠色譜范文2
關(guān)鍵詞：凝膠滲透色譜（GPC）；食品安全；應(yīng)用
中圖分類號(hào)： TS213.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/ki.jlny.2017.15.053
隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平不斷提高，人們對(duì)于食品安全問題也日益重視。國家對(duì)食品安全檢測(cè)工作也極為重視。食品安全檢測(cè)工作最重要的就是樣品前處理，樣品前處理的好壞直接影響到檢測(cè)結(jié)果的正確性。因此，在食品檢測(cè)中使用正確的前處理方法，可以提高工作效率和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
凝膠滲透色譜是最近十幾年迅速發(fā)展起來的一種樣品前處理方法，因其對(duì)分子量大的雜質(zhì)凈化效率高，可重復(fù)使用，適用范圍廣，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，在食品檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。
凝膠滲透色譜基于體積排阻的分離機(jī)理，通過具有分子篩性質(zhì)的固定相，來分離分子質(zhì)量不同的物質(zhì)。凝膠滲透色譜還可以用于分析化學(xué)性質(zhì)相同而體積不同的高分子同系物[1]。
1 凝膠滲透色譜（GPC）在食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究新進(jìn)展
1.1 GPC技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用研究新進(jìn)展
GPC技術(shù)常用在食品檢測(cè)中的樣品凈化，宋鑫等在檢測(cè)螃蟹中19種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留時(shí)應(yīng)用全自動(dòng)GPC-SPE聯(lián)合凈化，樣品用乙腈提取，凝膠滲透色譜和氨基固相萃取柱聯(lián)合凈化。用Bio-Beads S-X3凝膠為填料的凈化柱，以環(huán)己烷―乙酸乙酯（1∶1）為流動(dòng)相，泵流速為4.7 毫升/分鐘，檢測(cè)波長為254納米。收集9.0分鐘和15.5分鐘的流出液，并轉(zhuǎn)至SPE凈化。在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)經(jīng)GPC凈化的有機(jī)氯農(nóng)藥的收集時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，在單獨(dú)使用GPC時(shí)樣品凈化不完全，與SPE聯(lián)合使用后凈化效果和回收率較好[2]。馬杰等建立在線凝膠滲透色譜――氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定蔬菜、水果中有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，GPC 彌補(bǔ)了QuEChERS 方法凈化干擾物質(zhì)不徹底的問題， 從而降低分析背景， 改善峰形， 提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性 [3]。黃武等在檢測(cè)大豆中異丙甲草胺殘留量時(shí)用在線凝膠滲透色譜法，進(jìn)行前處理，簡(jiǎn)化了樣品前處理過程，且對(duì)環(huán)境污染較少，具有高效、經(jīng)濟(jì)、快速及簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，顯著提高前處理效率，減少分析時(shí)間，提高農(nóng)藥殘留分析的速度和靈敏度[4]。
1.2 GPC技術(shù)在食品檢測(cè)研究中存在的問題
GPC技術(shù)在國外已經(jīng)普遍應(yīng)用于樣品的前處理，但在我國應(yīng)用領(lǐng)域較少。GPC作為食品檢測(cè)中的一種全新的樣品前處理技術(shù)，能分離大分子類干擾雜質(zhì)，有效地將大分子類物質(zhì)從復(fù)雜的基質(zhì)中提取出來。GPC技術(shù)優(yōu)勢(shì)是可大大降低大分子基質(zhì)干擾，自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化程度高，且可以自動(dòng)濃縮和定容，減少了人工帶來的誤差，顯著提高方法的精密度和重現(xiàn)性。
但GPC技術(shù)作為一種新興技術(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問題，需要在今后的工作中解決。由于GPC柱子內(nèi)徑比較大，連續(xù)處理樣品的能力較慢，所需要的溶劑量較大。又因?yàn)樗占臉悠敷w積大，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的濃縮裝置要求較高，這大大減慢了實(shí)驗(yàn)分析的速度。此外，由于不同物質(zhì)分子大小、形狀以及凝膠阻滯作用的差異，可能會(huì)導(dǎo)致樣品分離不完全，較大分子量的物質(zhì)會(huì)提前流出不被收集而影響回收率，一些小分子干擾物會(huì)夾雜在樣品中而影響凈化效果。
2 凝膠滲透色譜（GPC）條件的選擇
利用GPC技術(shù)進(jìn)行樣品前處理時(shí)，所需選擇及優(yōu)化的條件主要是色譜柱的選擇，流速的選取以及收集時(shí)間的選擇，溶劑的選取等。孫磊麗等在測(cè)定甘草中16種農(nóng)藥殘留時(shí)選用填料為中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球體的S-X3玻璃柱作為GPC凈化柱，體積比為1∶1的乙酸乙酯―環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相，流速為5毫升/分鐘，前7 分鐘收集1份樣品，之后每1分鐘收集1份樣品，共收集28份樣品溶液，分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)[5]。呂飛等在檢測(cè)動(dòng)物源性食品中17種農(nóng)藥殘留時(shí)，在線凝膠滲透色譜：色譜柱為Shodex CL NpakEV-200 柱；流動(dòng)相：丙酮―環(huán)己烷（ 3∶7，V/V） ，流速0. 1毫升/分鐘，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10微升，檢測(cè)波長210納米，農(nóng)藥殘留組分在線收集時(shí)間段：4.35 ～ 6.35分鐘[6]。
3 展望
凝膠滲透色譜技術(shù)作為一種前處理技術(shù)已經(jīng)普遍應(yīng)用于樣品的凈化，S著GPC技術(shù)的不斷優(yōu)化應(yīng)用范圍越來越大，國外已經(jīng)研究出很多種成熟的GPC前處理方法。隨著國際形勢(shì)發(fā)展，我國也應(yīng)該對(duì)GPC技術(shù)進(jìn)行研究開發(fā)。目前有很多研究都將GPC技術(shù)與QuEchERS 前處理等聯(lián)合使用，使得現(xiàn)在的前處理可以聯(lián)合處理較為復(fù)雜的樣品，提高了工作效率和準(zhǔn)確度。現(xiàn)在的檢測(cè)儀器的精密度較高，對(duì)樣品處理較嚴(yán)格，GPC技術(shù)與其他前處理技術(shù)聯(lián)合使用可以去除雜質(zhì)的干擾，對(duì)于精密儀器是一種保護(hù)。如在線GPC與QuEchERS聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)可以去除樣品里的干擾和基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)樣品分析更準(zhǔn)確。因此，發(fā)展和研究凝膠滲透色譜技術(shù)在食品檢測(cè)方面有廣闊的發(fā)展前景。
參考文獻(xiàn)
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【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜； 薄層色譜； 心可寧膠囊
心可寧膠囊為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊(cè)（WS3B171494）收載的中成藥，由丹參、三七、冰片、蟾酥等8味中藥組成，主要用于治療冠心病、心絞痛、胸悶、心悸、眩暈等癥［1，2］。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證用藥安全、有效，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)本品進(jìn)行質(zhì)量研究，為心可寧膠囊的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下。
1 儀器與試劑
CAMAG REPROSTAR 3數(shù)碼成相系統(tǒng)和半自動(dòng)進(jìn)樣器（CAMAG），Sartorius BP211D電子分析天平（德國），電熱恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠），超聲清洗器（北京市醫(yī)療設(shè)備二廠），硅膠G和GF254薄層預(yù)制板（浙江臺(tái)州）。
對(duì)照品：華蟾酥毒基（8039202）、丹酚酸B（111562200403）、冰片對(duì)照品（110743200504）、膽酸對(duì)照品（100078200414）、去氧膽酸對(duì)照品（07242000207）均由中國藥品生物制品檢定所提供，甲醇、乙醚、醋酸乙酯等試劑均為分析純，水為三蒸水。
2 方法與結(jié)果
2.1 冰片的鑒別取本品10粒，傾出內(nèi)容物，加乙醚10 ml，超聲處理5 min，濾過，藥渣備用，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。取缺冰片的陰性對(duì)照品按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取冰片對(duì)照品，加醋酸乙酯制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取冰片藥材， 加醋酸乙酯制成每毫升含0.5 mg的溶液， 作為原藥材對(duì)照溶液。按照薄層色譜法［2］試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以V苯V醋酸乙酯（19∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與冰片對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。而空白對(duì)照品在與對(duì)照品相應(yīng)位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。
2.2 丹參的鑒別取［鑒別］（1）項(xiàng)下的藥渣，加甲醇100 ml超聲提取15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取缺丹參陰性對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取丹參藥材1 g，加甲醇10 ml，同法制成，作為原藥材對(duì)照溶液。再取丹酚酸B對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法［2］試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以V甲苯V醋酸乙酯V甲醇V甲酸V水（4∶8∶1∶4∶6）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，于紫外波長254nm下觀察后，再噴以1%三氯化鐵乙醇溶液顯色，于可見光下觀察供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。而空白對(duì)照品在與對(duì)照品相應(yīng)位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。
轉(zhuǎn)貼于
2.3 蟾酥的鑒別取本品10粒，傾出內(nèi)容物，加氯仿30 ml超聲提取15 min，濾過，濾液置分液漏斗中，加氫氧化鈉液（0.1 mol/L）20 ml。輕輕振搖，棄去氫氧化鈉液；氯仿液用水20 ml洗滌，棄去水洗液，氯仿液用無水硫酸鈉脫水，回收氯仿，殘?jiān)右掖?.5 ml使溶解，作為供試溶液。取缺蟾酥的陰性對(duì)照品按供試品溶液的的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。另取蟾酥0.2 g，磨細(xì)，用氯仿30 ml超聲提取15 min，濾過，濾液回收氯仿， 殘?jiān)靡掖?0 ml使溶解，作為原藥材對(duì)照溶液。再取華蟾酥毒基對(duì)照品，加乙醇制成每毫升含0.05 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。 照薄層色譜法［2］試驗(yàn)，吸取供試品溶液5 μl，對(duì)照品溶液3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以V氯仿V丙酮-V環(huán)已烷（3∶3∶5）為展開劑，二次展開，展距分別為8 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色，于可見光下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。而空白對(duì)照液在與對(duì)照品相應(yīng)位置上，無相同的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖3。
1.冰片對(duì)照品 2.冰片原藥材 3和4.供試品 5.陰性樣品
圖1 冰片鑒別圖譜（略）
2.4 牛黃的鑒別取本品10粒，傾出內(nèi)容物，加10 ml乙醇超聲提取10 min，加少量活性炭脫色，濾過，置水浴 上濃縮至約1 ml，作為供試品溶液。取缺牛黃的陰性對(duì)照品按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。取牛黃原藥材0.1 g，同法制備原藥材對(duì)照溶液。取膽酸和去氧膽酸對(duì)照品各2 mg，置5 ml量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法［2］試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以V氯仿V醋酸乙酯V甲酸（16∶9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱10～15 min，于紫外光燈365 nm下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照品、原藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而空白對(duì)照液在與對(duì)照品相應(yīng)位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖4。
圖2 丹參鑒別圖譜（略）
圖3 蟾酥鑒別圖譜（略）
圖4 紫外光燈365 nm下牛黃鑒別圖譜（略）
3 討論
本研究在原部頒標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上在提取方法和指標(biāo)以及展開系統(tǒng)等因素的選擇上進(jìn)行改進(jìn)提高。丹參的鑒別，由于制備工藝只采用了水提，故參照2005年版《中國藥典》Ⅰ部中丹參項(xiàng)下的鑒別要求，對(duì)丹參的水溶性活性成分丹酚酸B進(jìn)行鑒別研究，蟾酥鑒別增加了華蟾酥毒基對(duì)照品為指標(biāo)進(jìn)行分析；冰片的鑒別在原來理化鑒別的基礎(chǔ)上增加了薄層色譜鑒別，牛黃鑒別增加了去氧膽酸對(duì)照，并對(duì)展開條件進(jìn)行優(yōu)化，色譜更加穩(wěn)定、清晰。這些都進(jìn)一步完善了心可寧膠囊的定性鑒別。
本文方法操作簡(jiǎn)易，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，為心可寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善奠定了良好的基礎(chǔ)，如能建立相應(yīng)的含量控制指標(biāo)，則會(huì)更加完善，這有待進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
凝膠色譜范文4
關(guān)鍵詞： 凝膠色譜法；凝膠電泳法； 血紅蛋白
G633.91
DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)包括DNA的粗提取與鑒定、PCR技術(shù)和血紅蛋白的提取和分離等，是開展分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可或缺的物質(zhì)。血紅蛋白是人和其他脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞的主要組成成分，負(fù)責(zé)血液中的氧氣和二氧化碳的運(yùn)輸。
一、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理
血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等，可以分離不同種類的蛋白質(zhì)。
二、 血紅蛋白蛋白質(zhì)提取和分離技術(shù)方法有凝膠色譜法和電泳法。
凝膠色譜法是根據(jù)分子量的大小來分離蛋白質(zhì)的，而電泳法是根據(jù)各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身形狀、大小的不同來把蛋白質(zhì)分離開的。
1. 凝膠色譜法
凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理：在多孔球體的凝膠內(nèi)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小不同，大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；小分子通過凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動(dòng)慢。相對(duì)分子質(zhì)量的不同蛋白質(zhì)因此得以分離。凝膠材料是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。
2.凝膠電泳法
電泳法是帶電顆粒在電場(chǎng)中向電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。凝膠電泳法原理是：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負(fù)電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向和阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同，因而可聚集形成不同的條帶，因而達(dá)到分離的目的。影響蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度的因素中，蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)決定蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)方向，蛋白質(zhì)帶電荷量的多少?zèng)Q定電場(chǎng)作用力的大小，分子形狀和大小形成阻力大小，蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速率由電荷量、分子形狀和分子大小共同決定。
實(shí)驗(yàn)探究 蛋白質(zhì)為什么帶有帶電荷？
蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，還有一個(gè)羧基和一個(gè)氨基，在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基因會(huì)帶上電荷。
三、實(shí)驗(yàn)操作步驟
蛋白質(zhì)的提取和操作一般分為五個(gè)階段：材料的選擇和預(yù)處理、粗分離（細(xì)胞的破碎）、提取、純化（包括鹽析，層析，有機(jī)溶劑提取，有機(jī)溶劑沉淀等）和濃縮干燥及保存。我們?nèi)〔溉閯?dòng)物紅細(xì)胞（豬的新鮮血液）為材料，來進(jìn)行血紅蛋白的分離方法。
1.樣品處理及粗分離
⑴ 樣品前處理 包括細(xì)胞的破碎有機(jī)械方法、物理方法和化學(xué)及生物化學(xué)方法。
⑵ 細(xì)胞器的分離 從樣品水溶液中提取、用有機(jī)溶劑提取、利用表面活性劑提取和對(duì)提取物進(jìn)行保護(hù)。
①樣品分離器材：離心機(jī)，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸緩沖液。
②步驟包括：紅細(xì)胞的洗滌、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液和透析。采集的血樣要及時(shí)分離紅細(xì)胞，分離時(shí)采用低速短時(shí)間離心（500r/min離心2min），然后用膠頭吸管吸上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的0.9%的NaCl溶液，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液不再呈現(xiàn)黃色為止。將洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，加蒸餾水到原血液的體積，再加40%體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0min。然后轉(zhuǎn)移到離心管中，以2000r/min的速度離心10min，就可以明顯看到試管中溶液分四層，從上往下數(shù)，第一層為無色透明的甲苯層，第二層為白色波層固體，是脂溶性物質(zhì)沉淀層，第三層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第四層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的分層液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，靜置后分出下層的紅色透明液體。取1mL血紅蛋白溶液裝入透析袋子中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度20%mmol/L的磷酸緩沖液中（PH為7.0），透析12h即可。
⒉ 凝膠色譜操作
⑴凝膠色譜柱的制作 取長40cm，內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管，兩端磨平。玻璃管兩端色上合適的橡皮塞，中間打孔，孔徑為0.5mL插入移液管，在色V柱下端用移液管頭部作出口部位，連接一細(xì)的尼龍管，用螺旋塞控制尼龍管的打開與關(guān)閉，尼龍管的另一端放入收集色譜液的收集器內(nèi)。
⑵ 凝膠色譜柱的裝填凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配成配成凝膠懸浮液，在于下端連接的
尼龍管打開的情況下，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，輕輕敲動(dòng)色譜柱使凝膠裝填均勻。并立即用20mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌，使凝膠裝填緊密。
⑶血紅蛋白樣品的加入和洗脫 加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液下降到與凝膠面平，關(guān)閉出口。用吸管小心地將透析后的樣品加到色譜柱的頂端，并打開下端出口，是樣品滲入凝膠床內(nèi)。等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口，并加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)?shù)母叨龋B接洗脫瓶，打開下邊出口，進(jìn)行洗脫。待紅譜柱接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，連續(xù)收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
⑴原理 蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。
聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時(shí)，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動(dòng)的界面移動(dòng)，在分離膠表面形成了一個(gè)極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。
⑵具體操作包括：①紅細(xì)胞的洗滌 ；②色譜柱填料的處理；③凝膠色譜柱的裝填；④蛋白質(zhì)的分離。
凝膠色譜范文5
【關(guān)鍵詞】：中藥材 色譜法
【中圖分類號(hào)】R45;R96【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2008)4-0044-04
我國中藥材品種繁多､資源豐富藥用動(dòng)植物達(dá)1萬余種，在當(dāng)今世界“回歸自然”思潮影響下，尋找天然藥物的呼聲日漸高漲，因而對(duì)于我國這樣的中藥材大國首要任務(wù)是建立一套切實(shí)可行的鑒別方法和質(zhì)量保障體系。很多中藥材形態(tài)相似，加工處理后形態(tài)結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，目前采用的經(jīng)典植物鑒定，性狀鑒定和顯微鑒定等研究方法由于鑒定標(biāo)識(shí)建立在個(gè)體形態(tài)和客觀觀測(cè)水平上，因而存在主觀性強(qiáng)､重現(xiàn)性和穩(wěn)定性差等不足[1]。而分子標(biāo)記技術(shù)又存在方法不夠完善，資料不豐富，成本偏高無法推廣到生產(chǎn)第一線的缺點(diǎn)[2]。相比之下，色普法已成為中藥材鑒定中不可缺少的常規(guī)而有效的方法，尤其是對(duì)成分復(fù)雜的中藥材有分離分析鑒定的雙重優(yōu)勢(shì)。隨著化學(xué)分析色譜技術(shù)的成熟和廣泛應(yīng)用，20世紀(jì)70年代，人們將中藥中的化學(xué)成分展開于由各種不同載體制成的薄層板､紙片､膠片等物體上，不同的生藥成分顯現(xiàn)出不形狀，顏色的斑點(diǎn)或條紋等，人們可根據(jù)斑點(diǎn)或條紋的位置(Rf值)､顏色､數(shù)目等特征來鑒別生藥真?zhèn)魏唾|(zhì)量，從而創(chuàng)立了色譜法。目前常用的色譜法有薄層色譜法､氣相色譜法､紙色譜法､高效液相色譜法､毛細(xì)管電泳和凝膠電泳等。
1 薄層色譜法(TLC)
薄層色譜(TLC)由于操作簡(jiǎn)單､直觀､經(jīng)濟(jì)､適用范圍廣闊，在中藥鑒別中應(yīng)用頻率最高。目前，常用的薄層色譜法有高效薄層層析法､薄層掃描法和反相薄層色譜法等[3]。
1.高效薄層層析法(HPTLC)：HPTLC的薄板采用更加細(xì)致均勻的吸附劑用噴霧法制成，提高了分離效果，增強(qiáng)了重現(xiàn)性。張虹將榧屬植物葉的提取物經(jīng)TLC法初步分離，再用HPTLC法測(cè)定紫杉酸的含量，具有良好的回收率，可用于定量檢測(cè)[4];米莉莉等用高效薄層色譜掃描法對(duì)天然蟲草與人工蟲草菌絲體中核苷類有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)建立了不同蟲草樣品的熒光淬滅薄層色譜圖譜[5];伍慶等用HPTLC法建立了快速測(cè)定知母藥材中菝琪皂苷元的方法[6];曾長青等用高效硅膠薄層板對(duì)動(dòng)物藥不同蛇膽膽汁酸的14種組分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有相似組成[7]。
1.薄層掃描法(TLCS)：應(yīng)用薄層掃描儀將薄層板轉(zhuǎn)換成薄層圖譜的方法叫做薄層掃描法(TLCS)[8]。TLCS所得到的圖譜比目測(cè)的層析圖譜更為客觀準(zhǔn)確。張尊聽等以高效薄層色譜掃描法測(cè)定野葛根中游離葛根素和總葛根素含量[9];蘇淑分等使用薄層掃描法測(cè)定不同品種和產(chǎn)地化甘草并建立了指紋圖譜，可以快速的對(duì)藥材品質(zhì)作出評(píng)判[10];顏玉貞等完成了黃連的指紋圖譜研究[11];蘇微微等完成了黃參的薄層掃描指紋圖譜[12]。
1.3 反相薄層色譜(RPTLC)：當(dāng)薄層色譜中流動(dòng)相的極性大于固定相極性時(shí)，就形成了反相薄層色譜(RPTLC)，RPTLC主要用于極性成分復(fù)雜的藥材樣品。張子忠等對(duì)不同產(chǎn)地不同時(shí)間采收的蔓荊2種》荊素和對(duì)羥基苯甲酸進(jìn)行了RPTLC定量分析比較考察了多種因素對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，用于蔓荊子中上述兩種成分分析前者回收率93.9%，后者回收率91.2%[13]。
2 氣相色譜法(GC)
氣相色譜法(GC)以氣體為流動(dòng)相，適合于揮發(fā)性成分或通過衍生化后能汽化的成分的定性定量分析，有靈敏度高､操作簡(jiǎn)便､樣品無須化學(xué)前處理､提供信息量大等優(yōu)點(diǎn)。目前使用頻率較高的有裂解氣相色譜(適用于不揮發(fā)成分)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等。
2.裂解氣相色譜：該發(fā)將樣品放入裂解器內(nèi)，在一定條件下加熱樣品使其瞬間裂解，生成可揮發(fā)的小分子，立即被載氣帶入氣相色譜系統(tǒng)分析拄上，分離后得到裂解氣相色譜圖。袁敏等用此法比較了不同產(chǎn)地連翅的氣相色譜圖，13種樣品的色譜圖近似，重疊率達(dá)89%以上[14]。
2.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)：將氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合使用的一項(xiàng)技術(shù)即為GC-MS。徐勤等GC-MS對(duì)前胡中的白花前胡丙素，丁素和紫花前胡苷的含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)前胡兩種標(biāo)準(zhǔn)藥材的圖譜差異顯著，證實(shí)了藥典前胡的2個(gè)品種化學(xué)成分不同的說法[15];魏剛等采用GC-MS法對(duì)不同產(chǎn)地廣藿香､組織培養(yǎng)廣藿香､超臨界提取廣藿香､廣藿香對(duì)照品共21品種進(jìn)行了組分分析，發(fā)現(xiàn)石牌藿香與高要海南藿香相比，11個(gè)成分相對(duì)含量均有顯著差異，而高要與海南藿香無明顯差異[16];徐春艷等用此法測(cè)定出黃連與肉桂配伍后桂皮醛含量下降，下降程度與黃連比例有關(guān)[17];梁永樞等在水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中，用GC-MS對(duì)其成分進(jìn)行分析，分離出20個(gè)組分，鑒定出其中的6種組分，并首次從沉香揮發(fā)油中分析得到Guaiol和α-Copaen-11-ol[18]。
3 紙色譜
紙色譜(紙上層析)屬于分配色譜的一種。主要用于多功能團(tuán)或高極性化合物如糖､氨基酸等水溶性成分的分析分離。目前在中藥材中應(yīng)用較少。
4 高效液相色譜法(HPLC)
HPLC和其他分離方法相比有柱效高､靈敏度高､分離迅速性和重復(fù)性好等特點(diǎn)，若配以不同的檢測(cè)器，可對(duì)多種藥物成分進(jìn)行分析，一般用于含量測(cè)定，也可根據(jù)特征色譜峰進(jìn)行定性分析[19～20]。曾憲儀等用HPLC法測(cè)定枳殼､枳實(shí)中辛弗林和N-甲基酪胺的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枳實(shí)中辛弗林和N-甲基酪胺的含量高于枳殼[21];曹愛民等用HPLC法測(cè)定出了決明子中大黃酚含量，含量測(cè)定結(jié)果線性關(guān)系良好，平均回收率99%[22];楊國紅采用HPLC法對(duì)中成藥兩個(gè)制劑中桂皮醛進(jìn)行測(cè)量，樣品量在0～0.15范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，表明本法適用于對(duì)含桂皮醛成分的中成藥進(jìn)行質(zhì)量控制[23];另有文獻(xiàn)建立連翹､紅花､刺五加等的HPLC指紋圖譜，以鑒別區(qū)分不同來源､不同產(chǎn)地中藥材[24～25]。HPLC與現(xiàn)代檢測(cè)器相結(jié)合又產(chǎn)生了一些新技術(shù)：液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)，Park等用HPLC-ELSD法同時(shí)分離和測(cè)定了人參皂甙Rb､Rc､Rd､Re､Rf､Rg和Rh等[26];液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)，Van Breemen等首次將LC-MS技術(shù)用于人參粗提取物中的人參皂甙[27];反相高效液相色譜，張麗艷等用此法測(cè)定喜樹堿含量隨生長月份增加而遞增規(guī)律，為藥材采收時(shí)間的確定提供了依據(jù)[28]。
5 高效毛細(xì)管電泳(HPCE)
HPCE是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一種高效快速分離技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物[29]，有分離模式多､分離效率高､速度快和分析范圍廣闊的特點(diǎn)。王演以HPCE法對(duì)不同屬群大青葉藥材的理化特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)異地栽培的不同屬群大青葉藥材的化學(xué)成分和含量差異顯著[30];沈陽等測(cè)定不同種類甘草藥材中甘草酸的含量程良好線性關(guān)系，本法適用于甘草酸含量的測(cè)定[31];張朝暉等用高效液相色譜法測(cè)出大海馬､線紋海馬､刁海馬､刺海馬､小海馬､貢氏柄頜海龍､三斑海馬､粗吻海龍､海魚､擬海龍､尖海龍和寶珈海龍12種海馬海龍類藥材的電泳圖譜，為海馬海龍類藥材鑒定提供了依據(jù)[32]。等提取菟絲子種子植物蛋白用高效液相色譜法進(jìn)行生藥鑒定，結(jié)果表明，同屬不同種菟絲子的堿溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有顯著差異，根據(jù)其種子植物蛋白的電泳圖譜可有效鑒別菟絲子的來源[33];孫國祥等用HPCE法對(duì)射干的水提取液進(jìn)行指紋圖譜研究，計(jì)算出不同產(chǎn)地射干的CEFP的相思度(S)大于0.92，證明不同產(chǎn)地的射干在化學(xué)成分的分布上是十分相似的[34];王實(shí)強(qiáng)等采用HPCE，用外標(biāo)峰面積法測(cè)定嬰栗殼中可待因嗎啡和嬰栗堿的含量取得了滿意的效果[35];丁原菊等采用高校毛細(xì)管電泳法對(duì)紫柴胡中柴胡皂甙a與d對(duì)映體進(jìn)行分離和測(cè)定取得良好的結(jié)果，柴胡皂甙a與d的回收率達(dá)97.1%[36]。
6 凝膠電泳
凝膠電泳技術(shù)自20世紀(jì)80年代初傳入我國，石俊英教授等率先將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)的中藥學(xué)科相接合，經(jīng)多年潛心研究和實(shí)踐，創(chuàng)建了“中藥電泳鑒別法”新技術(shù)，并在動(dòng)植物類中藥材鑒別中廣泛應(yīng)用。目前重要的電泳鑒別多集中在蛋白質(zhì)的鑒別上，蛋白質(zhì)又分為貯藏蛋白和同功酶兩種。
6.貯藏蛋白電泳(凝膠蛋白電泳)：不同蛋白質(zhì)因存在分子大小空間結(jié)構(gòu)和電荷數(shù)目上的差異，可以通過電泳得到分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)與其他分析手段相比具有分辨率高､性能穩(wěn)定､凝膠孔徑可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的蛋白質(zhì)分離分析手段。金躍明等用緩沖葉提取樣品中蛋白質(zhì)，在10%連續(xù)的SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，結(jié)果鹿鞭與其主要偽品牛鞭的電泳圖譜有明顯區(qū)別，不同品種鹿鞭電泳圖譜也有明顯區(qū)別[37];趙華英等應(yīng)用蛋白質(zhì)電泳得出青葙子､牛膝子､雞冠花子､皺果莧子､莧子和反枝莧子的6種種子電泳圖譜，準(zhǔn)確的鑒別出了莧科6種種子類藥材[38];趙曉榮等用蛋白質(zhì)電泳得出了馬鹿鞭､海狗鞭､黃狗鞭和海象鞭的清晰圖譜，準(zhǔn)確的鑒別出了4種鞭類藥材，還觀測(cè)出黃狗鞭與馬鹿鞭樣品圖譜極為相似，從而提出用黃狗鞭代替馬鹿鞭的設(shè)想[39];李鋒等用SDS-PAGE法對(duì)羚羊角山羊角､黃羊角､綿羊角和藏羚羊角急性了電泳圖譜比較，發(fā)現(xiàn)各樣品有不同的蛋白質(zhì)成分，成功的區(qū)分了這5種角類藥材[40]。
6.同功酶電泳研究：同功酶是指催化作用相同而分子結(jié)構(gòu)不同的一組酶，它存在于同一種屬或同一個(gè)體的不同組織或同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。同功酶的結(jié)構(gòu)差異來源于基因差異，能穩(wěn)定的遺傳給后代。因此可以根據(jù)同功酶分子結(jié)構(gòu)差異用電泳法來分離。常由于電泳法分離的同功酶有乳酸脫氫酶同功酶､過氧化物酶同功酶和酯酶同功酶等。
6.2.乳酸脫氫酶(LDH)同功酶：20世紀(jì)50年現(xiàn)乳酸脫氫酶以來[41]，同功酶用于動(dòng)植物的分析鑒別也緊隨而至。李大均采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對(duì)巨蜥的血清､腦､腎､肝､心肌､骨骼肌和小腸的乳酸脫氫酶(LDH)同工酶進(jìn)行分離和測(cè)定.結(jié)果表明，LDH同工酶具有明顯的組織特異性[42];任文華等采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對(duì)刺猬(Erinaceusdealbatus)及游蛇科的黑眉錦蛇 (Elaphetaeniura)､紅點(diǎn)錦蛇(E.rufodorsata)和赤鏈蛇(Dinodonrufozonatum)等在冬眠期和活動(dòng)期骨骼肌､心肌､肝等的乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)同工酶譜進(jìn)行了分析，并用比色法測(cè)定了以上各種組織的LDH活性，結(jié)果表明：LDH同工酶的電泳圖譜只有紅點(diǎn)錦蛇的肝和骨骼肌中存在活動(dòng)期和冬眠期的明顯差異，在其余動(dòng)物兩個(gè)時(shí)期的組織中未表現(xiàn)出明顯變化，刺猬的肝臟LDH活性在冬眠期顯著地高于活動(dòng)期，而其余的動(dòng)物組織冬眠期LDH活性均顯著低于活動(dòng)期，三種蛇類組織LDH4均未見表達(dá)[43]。
6.2.過氧化物酶(POD)同工酶：在高等動(dòng)植物中，過氧化物酶廣泛而大量的存在著，并有較多的同工酶。李桂蘭采用聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳對(duì)菘藍(lán)不同器官的POD同工酶進(jìn)行分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)的POD同工酶酶譜具有一定的器官特異性和穩(wěn)定性，并且同工酶變化與生物的生長發(fā)育之間具有特異性關(guān)系，可為生物生長發(fā)育的調(diào)控研究提供參考[44];于晶等用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)對(duì)不同種源黃芩過氧化物同工酶進(jìn)行研究，再利用過氧化物同工酶譜帶聚類分析，可為不同種源黃芩的劃分提供參考[45];陳文強(qiáng)等采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對(duì)天麻3種變型的過氧化物酶(POD)的同工酶進(jìn)行了研究結(jié)果表明，天麻3種變型的過氧化物酶的同工酶活性不同，酶譜條帶數(shù)在5～7條之間，且具有特征譜帶.其中烏天麻和紅天麻的酶譜條帶數(shù)相同，兩者的酶譜條帶數(shù)均多于綠天麻;綠天麻､烏天麻和紅天麻的酶譜條數(shù)依次分別為5條､7條和7條;其中基本酶帶有5條，Rf值分別為0.06､0.24､0.83，0.89､0.98;烏天麻與紅天麻的相似度指數(shù)為0.86，說明這兩個(gè)種親緣關(guān)系近;烏天麻與綠天麻的相似度指數(shù)為0.71，反映它們之間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)[46]。
6.2.3 酯酶同工酶：酯酶同工酶是一類水解酶，能催化分子中酯鍵，酯酶同工酶在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛分布。張麗萍等用同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳快速簡(jiǎn)便的鑒別了蒙古黃芪和膜莢黃芪種子，為蒙古黃芪種子真實(shí)性的檢驗(yàn)提供理論依據(jù)[47]。
綜上所述，色譜法在中藥材分析和鑒別中的應(yīng)用已達(dá)到一定水平，但仍然存在一些不足，需要我們?cè)谥鸩教剿髦腥ジ倪M(jìn)，從而達(dá)到更有效､更簡(jiǎn)便的鑒別中藥材的目的。
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凝膠色譜范文6
中圖分類號(hào)：R780.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2016）02-0339-02
[Abstract]Lactoperoxidase has a natural antibacterial activity， which could be widely applied to food and had good antimicrobial antiseptic effect， such as Dairy and meat products， etc. The paper mainly reviewed the separation and pufication technology of lactoperoxidase including ？salting-out method， ultrafiltration method， coupling aqueous two-phase technology and chromatography technology.
乳過氧化物酶（lactoperoxidase，簡(jiǎn)稱LP）是過氧化物酶的一種，是存在于動(dòng)物乳中的一種天然抗菌物質(zhì)，常見于哺乳動(dòng)物的乳腺、唾液腺、淚腺及其分泌物中[1]。乳過氧化物酶在食品行業(yè)中應(yīng)用最廣泛的是乳制品，還可將其應(yīng)用到醫(yī)藥和肉制品行業(yè)中，具有較好的抑菌防腐效果。本文主要綜述了分離乳過氧化物酶的鹽析法、雙水相萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)以及色譜技術(shù)等。
1.鹽析法
鹽析沉淀法是酶分離純化過程中最常用的方法，其原理是在高濃度的鹽溶液條件下，大量鹽離子使水分子濃度相對(duì)降低，蛋白質(zhì)水合作用減弱，分子間相互凝聚沉淀析出，由于蛋白質(zhì)水合作用與蛋白質(zhì)本身的分子量、等電點(diǎn)等物理化學(xué)常數(shù)有關(guān)，所以在不同鹽析條件下，不同種類的蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀析出程度也不同，因而達(dá)到分離目的。鹽析法具有操作方法簡(jiǎn)便、無需大型昂貴設(shè)備和成本低安全性高等特點(diǎn)，適用范圍十分廣泛。通常把硫酸鈉、硫酸鎂、檸檬酸鈉、硫酸銨等用作鹽析劑，國內(nèi)有報(bào)道用硫酸銨鹽析法分離大豆酸沉蛋白、羔羊皺胃酶和多管藻R-藻紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白。鹽析法分離乳過氧化物酶還是較新的技術(shù)。
2.雙水相萃取技術(shù)
雙水相萃取體系是由兩種聚合物或是一種聚合物和一種鹽組成的，其原理是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的具有選擇性分配系數(shù)，當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于生物分子量大小、電荷作用和各種力（如疏水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境之間的相互影響作用，使物質(zhì)在上相和下相中的分布狀態(tài)不同（即分布濃度不同），形成雙水相體系。提取某一物質(zhì)，只需選擇適宜的雙水相體系，控制合適的條件（pH、雙水相體系物質(zhì)含量等），就可以得到適宜的分配系數(shù)，從而達(dá)到分離提取的目的[1]。與傳統(tǒng)的提取方法比較來看，雙水相萃取技術(shù)所使用的設(shè)備便捷、快速、經(jīng)濟(jì)，被分離物質(zhì)在溫和條件下進(jìn)行快速分離，其獲得產(chǎn)品的回收率和純度較高。目前，雙水相萃取技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸等生物活性產(chǎn)品的分離提取，并逐步走向工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程[2]。它為生物分子提供生物兼容的環(huán)境，具有連續(xù)操作空間，易于擴(kuò)大生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)有研究報(bào)道雙水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等，但是沒有應(yīng)用雙水相法提取乳過氧化物酶。利用雙水相技術(shù)，優(yōu)化提取牛乳中過氧化物酶提取的工藝條件，為雙水相技術(shù)在乳過氧化物酶提取分離方面應(yīng)用，提供基本的技術(shù)支撐，有很重要意義。
3.膜分離技術(shù)
膜分離技術(shù)是一項(xiàng)新興的高新技術(shù)，具有能耗低、分離過程中物質(zhì)不發(fā)生相變、操作簡(jiǎn)便、無二次污染、分離產(chǎn)物便于回收且分離效果佳等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)中的產(chǎn)品分離、純化等。常見的膜分離技術(shù)有微濾膜、超濾膜、納濾膜、反滲透膜及離子交換膜[13]。膜分離技術(shù)已廣泛的應(yīng)用的乳品工業(yè)中，主要應(yīng)用于乳清蛋白分離回收、乳清脫鹽、除菌、酪蛋白濃縮、乳蛋白質(zhì)分級(jí)分離等。膜技術(shù)主要是陶瓷膜技術(shù)分離酪蛋白和乳清蛋白以及超濾膜技術(shù)純化乳過氧化物酶。
4.色譜分離
色譜分離技術(shù)又稱層析技術(shù)分離，是一種用于分離成分復(fù)雜混合物中各個(gè)組分的有效方法。原理是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具備不同的分配系數(shù)，物質(zhì)在兩相體系作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，會(huì)隨流動(dòng)相一起運(yùn)動(dòng)，并在固相和流動(dòng)相間進(jìn)行多次反復(fù)的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離純化的目的。應(yīng)用于乳過氧化物酶分離的色譜技術(shù)可分為離子交換層析、親和層析、凝膠層析、吸附色譜和分配色譜等技術(shù)，此技術(shù)比較成熟，詳細(xì)介紹一下。
4.1 離子交換層析分離技術(shù)
離子交換層析中，基質(zhì)由帶有電荷的樹脂或纖維素構(gòu)成，帶有負(fù)電荷的為陽離子交換劑，反之為陰離子交換劑。離子交換色譜法分離蛋白質(zhì)組分原理是依據(jù)不同蛋白質(zhì)組分在一定條件的溶液中帶有相應(yīng)的電荷，根據(jù)蛋白質(zhì)帶電荷狀態(tài)不同會(huì)與帶相反電荷的離子交換劑的結(jié)合，按結(jié)合力的大小，在洗脫時(shí)從弱到強(qiáng)依次被洗脫下來而得以分離。
4.2 離子交換膜色譜提取乳過氧化物酶
Clovis K. Chiu等（1997）使用固定化磺酸根陽離子交換膜從乳清中分離乳過氧化物酶，此法優(yōu)點(diǎn)是速度更快，相對(duì)于離子交換色譜柱，膜分離使用更小的尺寸；缺點(diǎn)是生產(chǎn)越多的目標(biāo)物就需要越多的膜，增加生產(chǎn)成本，難以大量生產(chǎn)。Kerstin Plate等2006年提出了用帶有陽離子的選擇性吸附膜Sartobind S從生產(chǎn)酪蛋白所剩下的的乳清中來提取乳過氧化物酶，此法具有生產(chǎn)快的優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)。Linda Voswinkela等2011年提出使用陰陽離子交換膜色譜法（Sartobind Q and S nano），分兩個(gè)步驟（先過陰離子交換膜未吸附物質(zhì)再過陽離子交換膜）通過改變不同的緩沖液及pH值和洗脫液濃度從牛乳清中快速分離BSA，β-lactogloulin，ImmunoglobulinG，lactoperoxidase，lactoferrin多種蛋白，此法生產(chǎn)周期短，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
4.3 免疫親和層析（affinity chromatography）
將具有高度特異親和性的二種物質(zhì)之一以共價(jià)鍵形式結(jié)合到固定相，通過利用與固定相鍵合的物質(zhì)具有不同程度的親和性，將具有特異親和性的物質(zhì)成分與其他雜質(zhì)分離的色譜法。1989年Bodil Langbakk等人使用一種免疫親和色譜（配基結(jié)合免疫球蛋白G）從人乳中分離LP，其過程中LP和配基發(fā)生結(jié)合，利用含有2% SDS、pH 6.8和0.1 mol/L磷酸鈉緩沖溶液，將乳過氧化物酶洗脫下來，從而分離純化出純度較高的乳過氧化物酶[3]。
4.4 凝膠層析
凝膠層析又稱分子篩，按照分離純化的物質(zhì)是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，凝膠色譜又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。GFC主要是根據(jù)被分離樣品中各組分分子質(zhì)量大小的不同而進(jìn)行分離洗脫的一項(xiàng)高效的色譜技術(shù)。1963年P(guān)eter Z首先使用離子交換色譜從牛乳中分離出LP，之后使用凝膠色譜進(jìn)一步純化分離得到純度較高的LP[4]。2011年，Y. Morita等人以牛奶堿性蛋白為原料，將堿性蛋白溶解于磷酸鈉緩沖溶液，先使用SP-Sepharose填料平衡分離，并用0-1.5M NaCl進(jìn)行洗脫，將所得分離物質(zhì)收集再使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg進(jìn)一步純化得到高回收率的乳過氧化物酶。
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